sábado, 10 de mayo de 2014


La Coloración o Tinción de Gram



1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Esta tinción fue desarrollada empíricamente por el médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-).

En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiología, es fundamental la observación de los microorganismos. Esta observación se hace necesaria para su clasificación e identificación. Para ello se usa el microscopio tanto óptico como electrónico, y en sus diversas variantes (microscopio de rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro…). Nosotros abordaremos únicamente el microscopio óptico compuesto de dos lentes (condensador y objetivo).

Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiología se usa preferentemente el objetivo de inmersión, aunque para visualizar una preparación siempre se recomienda empezar por el objetivo de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de aumentos.

Al microscopio óptico hay dos formas de ver las preparaciones:

1.  Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las preparaciones son muy difíciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.

2.  Preparaciones fijadas y teñidas con el objetivo de inmersión. Se matan las bacterias, pero son más visibles y su contraste es superior y de mayor calidad.

Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un método de tinción que se usa universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Coloración o Tinción de Gram.  Es una tinción diferencial que basa su distinción en la estructura diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram (+) (pared más gruesa, y una sola capa de peptidoglucano) y de las Gram (-) (pared más delgada y dividida en dos partes).

Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram (+) se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram (-) perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina.
La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias Gram (+) poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las Gram (-), recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.

Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. Por ejemplo, las bacterias Gram (+) en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-).



2. MATERIALES Y METODOS

Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción de Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.

En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram (+) y Gram (-)) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.

Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.
Los pasos más estandarizados a nivel mundial, son los siguientes:
a. Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
La figura detalla a continuación el procedimiento descrito.



b. Coloración:
a) 1 minuto en Cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en solución de Lugol (mordiente)
d) se decolora con Alcohol de 95º (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en Fucsina o Safranina (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro

Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. A continuación, brindaremos algunos matices de los colorantes empleados:

1.  Colorante básico Cristal Violeta o Violeta de Genciana: Es el primer colorante que se echa sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante selectivo que tiñe a todos los microorganismos cargados negativamente. Se deja actuar durante un minuto y se lava con agua a continuación.
2.  Solución de Lugol. Producto compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente, que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases Se deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el colorante del todo.
3.  Alcohol 96º. El alcohol retira el colorante de las Gram (-) debido a su diferente estructura de la pared celular (tamaño de los poros). A veces se usa otro agente decolorante o disolvente orgánico como alcohol-acetona (1:1).

4.  Safranina o Fucsina: Colorantes básicos diferenciadores. Tiñen a las bacterias Gram (-). Se dejan actuar treinta segundos y se lavan con agua. Siempre se añade ésta contratinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis

Como puede verse en definitiva y una vez finalizada la tinción, las bacterias Gram (-) estarán teñidas de un color rosáceo, y las Gram (+) de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas claramente al microscopio óptico.


3. OBSERVACIÓN



Debe utilizarse el objetivo de inmersión. Se coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparación, se enfoca, preferentemente, con el micrométrico. Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol.







  


Pared Gram (+)
* capa densa y uniforme de 200 a 800 A)
* ácidos teicoicos
* polisacáridos
* proteínas (pocas veces)
* glicopéptido (50% del peso seco)

Pared Gram (-)
*capa interna delgada de 20 a 30 A  cubierta por capas externas de densidad menor)
* lipopolisacáridos
* lipoproteínas
* proteínas
* glicopéptido (10% del peso seco)