lunes, 14 de julio de 2014

GUÍA PRACTICA DEL LABORATORIO MICROBIOLOGICO DE AGUAS Y ALIMENTOS (PARTE 7)

Salmonella y Shigella
El aislamiento e identificación de Salmonella sp. es un proceso complejo que consta de varias fases; el recuento generalmente no se practica. Una vez tomada la muestra del alimento (25 g, según lo normatizado en el CAA) se mezcla con un medio de preenriquecimiento, como el caldo lactosado en una cantidad de 225 ml. Este paso podría llegar a obviarse con aquellos alimentos que ya contengan lactosa en su composición (farináceos, pastelería, etc).

El caldo se incuba entonces unas pocas horas (8) a 37 ºC para facilitar la recuperación de las salmonelas lesionadas. La segunda fase implica la siembra de una muestra de caldo en un medio de enriquecimiento que favorezca el crecimiento de las salmonelas a la vez que restringe o inhibe por completo el desarrollo de microorganismos competidores, como los coliformes. El término enriquecimiento selectivo se usa con carácter general para indicar que a un microorganismo o a un grupo de ellos se le permite crecer mientras que se inhiben los competidores; en esencia en esta fase se busca que aumente la proporción del microorganismo(s) requerido(s) respecto a todos los competidores. Los dos medios de enriquecimiento corrientemente utilizados con las salmonelas son el Caldo de Selenito – Cistina y el Caldo Tetrationato. El primero contiene selenito sódico, como agente inhibidor, aunque la hidrólisis de la lactosa que también forma parte del medio y que llevan a cabo muchas de las bacterias entéricas presentes, da lugar a una caída del pH que favorece el crecimiento de las salmonelas.

El caldo de tetrationato contiene varios agentes inhibidores como sales biliares, verde brillante y tetrationato que, en combinación, permiten que crezcan las salmonelas mientras que se inhiben eficazmente la mayoría de sus competidores. La incubación de estos caldos se realiza a 37º C durante 24 horas.

Después del enriquecimiento los caldos se emplean como inóculo de placas de medios selectivos, habiéndose empleado con este fin, tanto Agar SS como Agar-rojo violeta-bilis. No obstante, ahora se usan generalmente agar de MacConkey-verde brillante y agar desoxicolato-citrato; ambos contienen diversos agentes selectivos, los nutrientes usuales, lactosa y un indicador de pH. Las salmonelas al no fermentar la lactosa forman en estos medios después de una incubación de 24 horas a 37º C, colonias verdes e incoloras, respectivamente y por lo tanto se distinguen fácilmente de las colonias rojas originadas por los microorganismos fermentadores de la lactosa. Desgraciadamente muchos otros microorganismos dan en estos medios colonias indistinguibles de las de Salmonella sp., por lo que se necesitan otras pruebas antes de confirmar su aislamiento. La confirmación se realiza picando las colonias sospechosas y después de comprobada su pureza se resiembran en medios para comprobar la fermentación de otros carbohidratos, la producción de ácido sulfhídrico, la descarboxilación de la lisina y la motilidad.

Con tal que estas pruebas de tamizado (screening) produzcan los debidos resultados, las bacterias aisladas pueden considerarse como salmonelas, llevando a cabo la confirmación final con pruebas serológicas. La caracterización del serotipo específico puede hacerse con los correspondientes antisueros H y O, si bien para la confirmación suele ser suficiente con el empleo de antisueros polivalentes H y O (que son representantes de todos los serotipos que generalmente cabe esperar). Es probable que los concentrados de muestras necesiten ser enriquecidos previamente en agua de peptona amortiguada, para luego ser enriquecidos en caldo que contenga ya sea tetrationato, selenito, cloruro de magnesio o verde de malaquita. Estos, a su vez, pueden ser sometidos a subcultivo en medios como el verde brillante, sulfito de bismuto, agar de desoxicolata xilosa-lisina (DXL), citrato de desoxicolata o agar de MacConkey, examinándose luego las colonias sospechosas tanto bioquímica como serológicamente. Entre las pruebas de depuración bioquímica se deberá incluir: agar triple de azúcar y hierro, producción de indol, decarbosilasa y actividad de ß-galactosidasa. En las pruebas serológicas se incluirá la aglutinación con sueros polivalentes anti-o, anti-H y anti-Vi.
Es imprescindible la eliminación previa de cepas autoaglutinables. Cuando el análisis se realiza para detectar las S. typhi , el medio de cultivo aconsejado es la selenita F. El procedimiento de los tubos múltiples se utilizará para calcular el número de Salmonella presentes en el agua.  Debido a que las bacterias coliformes y la mayoría de cepas de Proteus vulgaris son antagónicas a la Shigella, es aconsejable elegir medios enriquecidos selectivos que reduzcan al mínimo las acumulaciones de compuestos volátiles y de los subproductos obtenidos a partir de estos microorganismos antagónicos. Se puede usar caldo nutriente con un pH ajustado de 8,0 (es el nivel de pH que menos favorece el crecimiento de bacterias coliformes). También es posible obtener un buen enriquecimiento de Shigella con un medio de cultivo autocitotóxico con base en caldo de tripticasa de soja conteniendo 1 mmol/litro de 4-cloro- 2-ciclopentilfenil ß-D-galactopiranosida, 2,5 g/litro de lactosa y sustancia amortiguadora de citrato a un pH de 6,2. La incubación debe hacerse durante 6-18 horas, a una temperatura de 35°C. Estríense las culturas en agar DXL cuando hayan transcurrido 6 y 18 horas. Sométanse las colonias sospechosas a pruebas de selección bioquímica y confírmese las colonias sospechosas con antisueros de Shigella (sueros polivalentes y de tipo.
La presencia en alimentos de cualquier serotipo de Salmonella es potencialmente peligroso como fuente de enfermedad para el hombre, bien por consumo de los alimentos o por contaminación secundaria de utensilios y equipo para el tratamiento e industrialización de otros productos. La norma microbiológica vigente para diversos alimentos (jamón cocido, fiambre de jamón, paleta cocida, fiambre de paleta, magro de cerdo cocido, fiambre de magro de cerdo, gelatinas comestibles, huevo entero pasterizado refrigerado o congelado, yema pasterizada refrigerada o congelada, huevo entero desecado, yema desecada, clara desecada, leche y productos lácteos, nata, etc.) exige la ausencia de Salmonella en 25 g.

a) Enriquecimiento en medio líquido no selectivo. Homogeneizar 25 g de la muestra con 120 ml de agua de peptona estéril, e incubar a 37ºC durante 12-24 horas.

b) Enriquecimiento en medio líquido selectivo. Pasar 10 ml del homogeneizado anterior a un frasco que contenga 100 ml de caldo tetrationato (Müller-Kauffmann). Incubar a 37ºC durante 24 horas. Para detectar ciertos serotipos que pueden no crecer adecuadamente en las condiciones anteriores, puede realizarse un enriquecimiento selectivo complementario en otro medio (generalmente caldo selenito cistina) incubando y también a una temperatura distinta (43ºC).

c) Siembra en medios sólidos selectivos. Pasar un asa de siembra del caldo de enriquecimiento a sendas placas de medio selectivo (agar SS Salmonella-Shigella y agar XLD) y extender el inóculo. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

d) Estudio de las colonias sospechosas. En agar SS las colonias típicas son incoloras y el medio vira a amarillo, en agar XLD son rojas y transparentes. Algunas cepas dan colonias con el centro negro.

e) Uilización de glucosa y lactosa. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Kliger incubándose a 37ºC durante 24 horas. La coloración amarilla en el fondo indica la utilización de glucosa, mientras que la de la superficie indica la de lactosa. El fondo negro refleja la presencia de H2S.



f) Utilización de manitol. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Manitol incubándose a 37ºC durante 24 horas. La coloración amarilla indica la utilización de ese azúcar.


g) Ureasa. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Urea incubándose a 37ºC durante 24 horas. La presencia de color rosa indica resultado positivo. Se consideran Salmonella las colonias glucosa + y lactosa - en los tubos de agar hierro de Kliger (con o sin fondo negro), manitol + y que además sean negativas a las otras pruebas bioquímicas.


Salmonella pertenece a la Familia Enterobactereaceae, al Género Salmonella. Salmonella y Arizona por la homología de su DNA se le considera una sola; la nomenclatura y clasificación no está establecida definitivamente. Bacilo GRAM (-) aerobio y anaerobio facultativo, producen ácido a partir de la glucosa y son generalmente aerogénicos. Se distinguen 7 distintos subgrupos, cada cual con su fenotipo definido y son serotipificados por antígeno O somático,Vi de superficie y antígenos flagelares fase I y II. Según ultima clasificación, se establece la siguiente nomenclatura estimándose que el 99% de los aislamientos en clínica corresponde a al subgrupoI.  El período de incubación de la enfermedad es desde las 6 hasta 48 hrs dependiendo de la dosis infectante la que puede ser desde 15 a 20 UFC para algunos serotipos.

No todos los serotipos son patógenos para el hombre y animales. La incidencia de salmonelosis se ha visto incrementada en los ultimos 20 años estimándose que los casos anuales van desde 740.000 a 5.000.000 de los cuales no más del 1% es detectado. Los factores más importantes para su control pasa por una adecuada educación al consumidor y por la implementación y mantención de adecuados controles de calidad por parte del laboratorio de la industria de alimentos la que preferentemente utiliza métodos rápidos para realizar screening en sus productos mediante kits rápidos los que son eficientes en detectar partidas negativas pero en el caso de reacciones presumiblemente positivas se debe confirmar con los métodos convencionales.


Una de las fuentes principales son los alimentos contaminados con éste microrganismo especialmente los alimentos de origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas. Los alimentos se analizan para pesquizar Salmonella por las siguientes razones:

a. Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria.

b. Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Salmonella.
  
Es la segunda causa más común de enfermedades transmitidas por alimentos. Es responsable de millones de casos al año de enfermedades transmitidas por alimentos; Origen: huevos crudos y mal cocidos, pollos y carnes mal cocidas, productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales. Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son:

-carne (vacuno, cerdo, pollo),
-productos cárneos (jamón, salame, vienesas),
-ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),
-productos de pastelería (cremas) y
-productos lácteos (queso, queso de cabra, etc).



Staphilococus aureus


Los métodos para el examen de S. aureus pueden agruparse en dos: primero recuento de estafilococos y segundo comprobación de la presencia de enterotoxina en el alimento. Dado que sólo un 50 % aproximadamente de las cepas de S. aureus son enterotoxigénicas, se deduce que en la investigación de brotes de toxiinfecciones alimentarias el segundo método es más concluyente; además, a partir de ciertos alimentos corrientemente se aisla un pequeño número de S. aureus sin que ello debe considerarse peligroso.

El rango de medios selectivos, a base de agar, que se ha utilizado para la enumeración de S. aureus en los alimentos es especialmente grande y como en el caso de C. perfringens, la ICMSF ha realizado un estudio comparativo de algunos de los más empleados (Rayman et al., 1978). Concluyó que el Agar de Baird – Parker era el que mejor se comportaba. Este medio (Baird – Parker) contiene como agentes inhibidores telurito potásico y cloruro de litio y como sistema indicador yema de huevo. Previamente el inóculo se lleva a un medio preselectivo como lo es el Caldo Giollitti – Cantoni adicionado con telurito de potasio como inhibidor, incubándose 24 hs a 37° C.

Después de 24 – 48 horas de incubación a 37º C, S. aureus produce en el medio colonias negras rodeadas de una zona clara (de 2 – 5 mm de anchura); en el interior de esta zona hay otra opaca más pequeña que sólo se desarrolla en la última fase de la incubación. Estas reacciones son muy específicas de S. aureus, pero debe hacerse una prueba confirmativa (reacción de la coagulasa).

La detección de enterotoxina en los extractos de alimentos o en los filtrados de cultivos aislados de los alimentos sospechosos implica normalmente procedimientos serológicos que son más sensibles y más baratos que las pruebas previamente utilizadas. Dado que las concentraciones de enterotoxina en los alimentos son muy bajas deben emplearse métodos de extracción y concentración; puesto que estas técnicas requieren mucho tiempo, últimamente se han introducido técnicas más rápidas. Los métodos de hemaglutinación y radioinmunoensayo dan los resultados en pocas horas y además no necesitan que se concentren los extractos de los alimentos.
S. aureus pertenece a la familia Micrococcaceae, al Género Staphylococcus. El género Staphylococcus está constituído por diecinueve especies y se diferencian de otros géneros de la familia, en base al contenido de guanina y citosina (G + C) en el DNA, composición de la pared celular y su habilidad de crecer anaeróbicamente y fermentar la glucosa bajo esas condiciones (Bergdoll, 1979, Kloos y Schleifer, 1986).
Las tres especies mas conocidas de Staphylococcus
 S. aureus
 S. epidermidis
 S. saprophyticus
 Se diferencian por su capacidad para:
* producir coagulasa
* fermentar el manitol (aeróbica y anaeróbicamente),
* producir una nucleasa termoestable
* composición de la pared celular (Bergdoll,1979).

S. aureus es una bacteria inmóvil, Gram positiva, esférica y usualmente agrupada en racimos, anaerobia facultativa, catalasa positiva. Produce generalmente la enzima coagulasa, fermenta el manitol y otros azúcares, formando ácido pero no gas.
El crecimiento ocurre en un amplio rango de temperatura 6,5 a 50ºC, siendo el óptimo 30-40ºC.


Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relación con el hombre y la gran mayoría de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad.
Staphylococcus aureus es un microorganismo fácilmente destruído por tratamientos térmicos con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de sanitización o contaminación cruzada.

Los alimentos se analizan para investigar S.aureus por las siguientes razones:
* Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria.
* Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Staphylococcus aureus.
* Demostrar contaminación post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano con alimentos procesados o exposición del alimento a superficies inadecuadamente sanitizadas.

Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son:
- carne (vacuno, cerdo, pollo),
- productos cárneos (jamón, salame, vienesas),
- ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),
- productos de pastelería (cremas)
- productos lácteos (queso, queso de cabra, etc)

El objetivo de realizar análisis de Recuento de S. aureus es detectar el número de unidades formadoras de colonias (UFC.) y el de realizar NMP es estimar la densidad de bacterias S. aureus en un alimento como indicador sanitario. Se aplica el método de recuento en placa en alimentos en los cuales se puede detectar > 100 células /g o ml. Se aplica la técnica NMP en productos en los cuáles el número de S. aureus es bajo, como por ejemplo en alimentos deshidratados o congelados. También es útil en alimentos que contengan una gran población de especies competitivas. Aunque el género Staphylococcus está integrado por un amplio número de especies con posibilidad de producir enterotoxinas es indudable que S. aureus es con mucho la que presenta un mayor porcentaje de cepas enterotoxigénicas y por lo tanto productoras de intoxicaciones por alimentos. La presencia de estafilococos en alimentos puede deberse a una procedencia endógena como consecuencia de infecciones de origen animal, o exógena, a partir de manipuladores fundamentalmente. La investigación de los brotes de intoxicación estafilocócica diagnosticadas en los últimos años señala que la procedencia humana de estos procesos es más frecuente que la animal.


Procedimiento: Preparar un homogeneizado del alimento (10 g) en agua de peptona (90 ml) como se ha descrito para los recuentos de microorganismos viables. Pipetear 0,1 ml del homogeneizado inicial (1/10) y de la dilución 1/100 y depositarlo en la superficie de sendas placas de Petri con el medio de Baird-Parker solidificado. Extender con varilla de vidrio previamente esterilizada por inmersión en alcohol y posterior flameado. Incubar a 37ºC durante 24 – 48 h y contar el número de colonias que aparecen en las placas. Se consideran estafilococos sospechosos de ser enterotoxigénicos los que dan colonias de color negro, convexas y rodeadas de un halo más claro en el medio de Baird-Parker.

Pruebas confirmativas para estos microorganismos son la prueba de la DNAsa y la de la coagulasa. La desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patógenas de S. aureus. A partir de las colonias típicas crecidas sobre Baird-Parker se siembra una estría sobre la superficie del agar DNAsa. Se incuba durante 24 horas a 37ºC. Sobre el crecimiento se vierte HCl 1N y se espera unos minutos a que se produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente alrededor del crecimiento. En un tubo de 10x75 mm se vierten 0,3 ml de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se le añade una colonia típica y se observa a partir de los 30 minutos. La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.



Bacillus cereus


En los alimentos sospechosos sólo se requiere la determinación cuantitativa de B. cereus que, para tener importancia, debe alcanzar valores grandes. Los medios selectivos empleados para el recuento de este microorganismo (por ej., Holbrook y Anderson, 1980) llevan frecuentemente polimixina ya que Bacillus sp., no es afectado por este antibiótico. A menudo se les incorpora un sistema indicador a base de yema de huevo y posiblemente manitol, junto con un indicador de pH; B. cereus se identifica, de forma presuntiva, por la zona opaca que rodea las colonias después de 24 horas de incubación a 37º C, zona que es igual a la observada en S. aureus cultivado en medios con yema de huevo. B. cereus no fermenta el manitol por lo que sus colonias son pálidas, con una coloración púrpura del agar que las rodea, mientras que las bacterias fermentadoras del manitol dan unas colonias amarillas.
  • Son bacterias Gram positivas, familia bacillaceae
  • Aerobio y anaerobio facultativo
  • Esporulado: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta.
  • Crecen entre los 10° - 48º C, la temperatura óptima es entre 28° - 35º C.
  • Generalmente son móviles con flagelos perítricos.
  • Poseen antígenos somáticos y flagelares y de esporas.
  • Las reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan reacciones cruzadas con otros géneros.
  • Los antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias esporas
  • pH = 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95.
  • Para la germinación en el momento que se agota el medio, al final de la fase exponencial ocurre la esporulación porque son menos exigentes. La germinación de las esporas es a 30º. Las esporas son moderadamente resistentes al calor. Resisten 100º durante 5-10 minutos.


Entre las enzimas y toxinas producidas por ésta bacteria, podemos encontrar: Lecitinasa (fosfolipasa), se puede detectar porque estos microorganismos dan lugar a una reacción típica de precipitación cuando crecen en medios con yema de huevo. Es una sustancia que puede estar relacionada con efectos necróticos de células intestinales. Hemolisina, produce la lisis de glóbulos rojos, Factor letal, produce la muerte de conejos cuando se inyectan por vía endovenosa, Factor de permeabilidad vascular, produce alteraciones en vasos sanguineos ya que altera su permeabilidad, Toxina necrótica, relacionada con la lecitina y produce necrosis de las células del epitelio intestinal, Toxina emética, produce vomitos,  Toxina estable a 126º durante 90 minutos. Estable a pH 2 y 11 durante 2 horas, puede sobrevivir en los alimentos y Factor del asa ileal de conejo, origina diarrea y salida de líquido en experimentación. Todas esta sustancias se producen a lo largo de la fase exponencial o al final de la misma por las células vegetativas

Bacillus cereus, es:
  • Ubicuo
  • Se puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e industrializados
  • Cuando se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica aparente
  • Se empezo a asociar a alimentos en los años 50.
  • En los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados pero si se dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas, conviene enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración.
  • En la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no son esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la posterior germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser detectado.
  • Alimentos que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras, sopas, salsas, ensaladas, arroz hervido.
Su poder patógeno se fundamenta en:
  • Toxina hemética, enterotoxina, la parte activa es una sustancia de bajo peso molecular (10.000), es estable al calor (resiste 120º C durante 1 hora)
  • Factor del asa ileal de conejo, enterotoxina diarreica, proteina de peso molecular 38.000 – 50.000, se inactiva por calentamiento a 56º C durante 5 minutos, es termolábil.
Como cuadro clínico clásico de intoxicación, tendremos:
Síndrome emético, nauseas y vomitos se producen al cabo de 1 – 5 horas, la diarrea no es tan frecuente.
Síndrome diarreico, período de incubación de 8 a 10 horas, dolor abdominal y diarrea, la clínica desaparece a las 12 – 24 horas.
En un brote de intoxicación va a ser fácil identificarla, mientras que cuando se encuentra en número bajo es más complicado por acciones competitivas.

Agar manitol

Las colonias aparecen rodeadas de un halo de precipitación blanco sobre fondo rosa-rojo-violeta, las que fermentan el manitol de color amarillo, a las 24 horas las colonias son circulares y lisas, a las 48 horas grandes y rugosas con estrías, nº de colonias x factor de dilución = nº U.F.C. / g. Las colonias sospechosas se trnasfieren a un agar nutritivo y se incuba. Sembramos en agar para anaerobios sin glucosa ni indicador, sembramos en picadura, se añade parafina, incubamos a 31º 24 hora, si hay crecimiento es Bacillus cereus.
Caldo glucosa sin fosfato, prueba de Voges Proskaguer (VP+), detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y añadir cristales de creatina para que la reacción sea más rápida.



Agar nutritivo glucosa, incubar a 31º 24-48 horas, se realiza la tinción con fuscina y el polihidroxibutirato (material de reserva) no se tiñe. Caldo nitrato, la prueba es positiva si hay transformación del nitrato en nitrito.
Movilidad, se siembra en agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo es movil crece por todo el medio.
Se puede calcular el NMP cuando se sospecha que el alimento tenga menos de 10 UFC/ml. A partir de diluciones decimáles se siembran en: caldo tripticasa a 31º durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se confirma.
Como medidad de prevención y control, observaremos:
  • Evitar que se multipliquen en los alimentos
  • Cocinar los alimentos antes de servirlos
  • Enfriarlos rapidamente y refrigerar
  • Control en los platos preparados
  


Mohos y Levaduras

 

Las levaduras y los mohos, constituyentes de la flora micótica total a investigar, generalmente se han cultivado en medios de pH bajo (3,5 - 5,5) y a temperaturas de 20° - 30º C si bien muchas bacterias crecen en estas condiciones. Para inhibir las bacterias se utilizan antibióticos de «amplio espectro» que incorporados a los medios de cultivo inhiben el crecimiento de aquéllas. Un medio típico es el agar oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura, que lleva como agente selectivo oxitetraciclina y entre otros nutrientes glucosa y que se ajusta a un pH relativamente alto, aproximadamente 6,5 (Mossel et al., 1970).



Los métodos de ensayo de las aflatoxinas difieren algo, dependiendo del alimento. Generalmente el alimento se pica suficientemente y a continuación se extrae con un solvente adecuado, como el cloroformo. Se purifica el extracto y la fase siguiente de detección implica algún tipo de cromatografía, generalmente en capa fina. Con el empleo de solventes que separan netamente las toxinas, se pueden comparar cualquier tipo de manchas que den fluorescencia bajo la luz UV con los correspondientes estándares. El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no sólo del potencial de los mohos para deteriorar los alimentos, sino también del potencial de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre es sensible, así como su capacidad para provocar infecciones e incluso, reacciones alérgicas a personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. En cuanto al significado para la salud del consumidor, la acción de las levaduras es meramente infectiva.


De todo esto se deduce que existe un riesgo potencial en la contaminación fúngica de los alimentos y, por ello, para conocer la calidad microbiológica de diversos productos, se procede a la evaluación de su tasa de contaminación por mohos y levaduras. Después del recuento se puede realizar una identificación aproximada de las colonias de levaduras y mohos que aparecen en la placa. La identificación de las levaduras conlleva una serie de pruebas fisiológicas y bioquímicas, por lo que la metodología en este punto se aproxima, en cierta medida, a los sistemas clásicos de identificación bacteriana.

Las técnicas de identificación de mohos se encaminan, casi exclusivamente, al estudio de la morfología, tanto macroscópica como microscópica: crecimiento, aspecto de las colonias, características de las hifas, formación de exudado, pigmentos, micelio, esporas, etc.

Procedimiento: La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa. A partir de la serie de diluciones decimales se añade 1 ml de la dilución 1/10 y 1/100 en sendas placas de Petri vacías en las que se añade medio Rosa de Bengala con cloranfenicol (20 ml/placa aproximadamente) atemperado a 45 - 47ºC. Las placas se incuban, SIN INVERTIRLAS, a 24ºC durante 4 - 5 días. El recuento se realiza en la placa que presente un crecimiento entre 0 - 50 colonias.


El crecimiento de mohos y levaduras se caracteriza por el aspecto algodonoso y cremoso de sus colonias, respectivamente.  Para la identificación de mohos se coge un trozo periférico de una colonia y se homogeneiza en un porta sobre el que previamente se ha añadido una gota de lactofenol. Se protege la preparación con un cubre evitando que queden burbujas de aire. Se le añade una gota de aceite de inmersión y se observan al microscopio las esporas, los cuerpos fructíferos, el micelio, etc.



Clostridios Sulfito – Reductores

Contrariamente a lo que sucede con las salmonelas el aislamiento de un pequeño número de C. perfringens a partir de los alimentos no significa necesariamente que exista peligro de toxiinfección alimentaria; sólo cuando hay un gran número existe verdadero peligro, por lo que con este microorganismo las técnicas de recuento son imprescindibles. Se emplean las siembras (en placa, por vertido o «en superficie») de diluciones de homogeneizados del alimento, junto con medios selectivos. Se han desarrollado muchos de estos medios para C. perfringens: la mayoría a base de agar, al que se incorporan los nutrientes más convenientes, sistemas indicadores y agentes selectivos.

La ICMSF ha estudiado comparativamente los métodos de enumeración de C. perfringens de los alimentos y ha concluido que el agar sulfito-cicloserina proporciona las mayores recuperaciones de esta bacteria, además del número más bajo de falsos positivos (Hauschild et al., 1977). Este medio contiene cicloserina, un antibiótico, y además un sistema indicador que se basa en que C. perfringens, como otros muchos clostridios, reduce el sulfito o sulfuro, dando colonias negras en presencia de una sal de hierro. 


Después de la incubación de las placas en anaerobiosis a 37 ºC durante 24 horas, las colonias sospechosas se inoculan en un medio confirmativo, observando la movilidad (C. perfringens es inmóvil) y la capacidad de reducir los nitratos a nitritos (Hauschild y Hilsheimer, 1974). Otra prueba confirmatoria consiste en sembrar las colonias sospechosas en placas de agar yema de huevo, a una de cuyas mitades se le añade antitoxina de C. perfringens. Después de la incubación las colonias crecidas en la mitad de la placa carente de antitoxina, están rodeadas de una zona opaca (reacción de Nagler), mientras que las de la otra mitad no muestran cambios ya que la reacción ha sido específicamente neutralizada por la antitoxina (Cruickshank et al., 1975).

 

C. botulinum corrientemente no se enumera en los alimentos y las pruebas que con él se emplean implican generalmente la detección de toxinas botulínicas en el alimento y el aislamiento de C. botulinum, seguido de la detección de sus toxinas. Debe tenerse un cuidado extremo al analizar los alimentos sospechosos y es necesario el consejo de un experto antes de embarcarse en tales análisis. Si se dispone de buen laboratorio los homogeneizados de alimentos se pueden examinar directamente al microscopio poniendo de manifiesto la presencia de células enteras y de esporas con ayuda de las técnicas de tinción fluorescente. También deben sembrarse en estría muestras de alimentos en agar sangre, preferiblemante con yema de huevo para que se obtenga después de una incubación de 3 días a 30º C en anaerobiosis la típica reacción de color de C. botulinum (esto es, una zona opaca alrededor de la colonia y una «capa perlácea» en la superficie).


Las colonias sospechosas se siembran después en caldo de carne cocida y en el líquido sobrenadante se investiga la presencia de toxina botulínica después de un tiempo de incubación suficiente. (N.B. el ensayo de la toxina se realiza a veces en caldo de carne inoculado directamente con muestras del alimento sospechoso). Finalmente en los extractos del alimento original puede intentarse el ensayo directo de la toxina. En esencia los ensayos implican la inoculación de los extractos del alimento o de los sobrenadantes de los cultivos a ratones, de los que algunos se han protegido con antitoxinas A, B o E mientras que otros no lo han sido. Los ratones inoculados se observan algunos días y si mueren los que no se protegieron con las correspondientes antitoxinas con los signos típicos de botulismo, mientras que viven los que lo fueron con la antitoxina específica, la prueba es positiva al correspondiente tipo de C. botulinum.

Antes se han descrito los métodos de aislamiento de Clostridium botulinum, C. perfringens y Bacillus cereus, pero puede necesitarse la enumeración del número total de microorganismos esporulados del alimento. Como medida preliminar, las muestras o diluciones que los contengan deberán calentarse a 80º C durante 10 minutos para destruir todas las células vegetativas, después se enfrían y siembran. El calentamiento estimula la germinación de las esporas (choque térmico), proceso que frecuentemente es difícil de iniciar sin un estímulo adecuado. Para el recuento de Bacillus sp. se utilizan medios nutritivos estándar, incubándose aeróbicamente. Obviamente los miembros de este grupo que se encuentran en forma vegetativa en los alimentos, no se incluyen en el recuento.

Para los clostridios se necesita incubar en jarras cerradas cuyo aire es sustituido por hidrógeno. los clostridios anaerobios obligados requieren la inclusión en la jarra de un catalizador, como el paladio que convierte el oxígeno residual en agua, al combinarse con el hidrógeno (Robbs et al, 1971). A veces se realiza un pre-enriquecimiento preliminar de la muestra, diluida en un medio de carne cocida, sin embargo, para verificar el recuento, es preferible la siembra directa en un medio sólido, nutritivamente complejo. Generalmente se emplea el medio diferencial reforzado para clostridios (Differential Reinforced Clostridial medium) de Gibbs y Freame (1965), que aunque líquido presenta muchas ventajas. los recuentos son mayores que en medios sólidos y no se requieren jarras anaeróbicas.


No pueden hacerse recuentos exactos pero si se inoculan diluciones decimales se obtienen cifras que se encuentran en un rango de valores que difieren en un factor de diez (por ej., > 1.000 pero <10.000 por g). El medio contiene un sistema indicador a base de una fuente de azufre y una sal de hierro, de forma que el obscurecimiento del medio indica que han crecido clostridios la mayoría de los cuales producen ácido sulfhídrico.  Las colonias de Clostridios sulfito reductores aparecerán de color negro debido a la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito. Transcurridas 48 h, contar el número de colonias negras desarrolladas en la totalidad de la columna de agar, sin tener en cuenta las puntiformes.

 


El resultado se expresará como número de esporas de clostridios sulfito reductores en el volúmen de agua sembrado (20 ml a 100ml). Con objeto de evitar la dificultad de recuento que puede producirse al confluir las colonias desarrolladas se efectuará una primera lectura a las 24 h, y si por este motivo no es posible el recuento a las 48 h se dará la lectura de las 24 h como resultado aproximado. El grupo bacteriano de los sulfito – reductores está integrado por microorganismos pertenecientes al género Clostridium y que tienen en común reducir el sulfito a sulfuro. Son muy resistentes por su capacidad de esporular. Se suelen usar para apreciar la calidad higiénica del agua y productos animales. Su número es escaso en productos frescos. La capacidad de esporular de estos microorganismos les confiere una gran resistencia. La detección de Clostridium sulfito – reductores se logra utilizando medios de cultivo en cuya fórmula interviene el sulfito de sodio, como el medio SPS, en los que, por la capacidad de estos microorganismos de reducir tal sustancia, se produce sulfuro de hierro al actuar sobre el compuesto de hierro. La presencia de sulfuro de hierro se pone de manifiesto por la aparición del color negro de las colonias.