lunes, 28 de marzo de 2016

NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO de AGUAS y ALIMENTOS (IV Parte)

“El médico del futuro no tratará el cuerpo humano con medicamentos, más bien curará y prevendrá las  enfermedades con la nutrición" 
(Thomas Alva Edison)



NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO 
de AGUA y ALIMENTOS (IV Parte)





h.  SALES DE CURADO Y SUSTANCIAS ANÁLOGAS

En sus comienzos el curado se desarrolló para conservar ciertos alimentos mediante la adición de cloruro sódico. Una impureza de la sal, el nitrato sódico, se vio que era el responsable de la aparición del pigmento rosa – rojizo de la carne, el llamado color de carne curada. Más tarde se comprobó que el compuesto responsable de la aparición del color era el nitrito y no el nitrato que se originaba por reducción bacteriana del último. En la actualidad se consideran sales de curado al cloruro sódico y al nitrito o nitrato de sodio o de potasio.  Aunque el curado constituía originalmente un mecanismo de conservación por salazón, se han desarrollado simultáneamente con aquél varios miles de procesos adicionales principalmente fermentación, ahumado, desecación y aplicación de calor. En los últimos años se han ideado una serie de productos curados que solo permanecen estables en condiciones de refrigeración. De hecho la mayoría de los productos cárnicos curados deben mantenerse en refrigeración para que conserven su inocuidad y salubridad y durante las últimas dos décadas, hasta el envasado de muchos tipos de productos curados, ha supuesto un factor importante para prolongar el tiempo durante el cual el producto mantenga su salubridad.



Además de las sales del curado y de los procesos con ellas relacionados, ya mencionados, en muchos productos cárnicos curados se emplean aditivos conocidos colectivamente como adyuvantes. En ellos se incluyen: ascorbatos, fosfatos, glucono lactona y azúcares. Los adyuvantes se emplean fundamentalmente para alcanzar o mantener ciertos cambios deseables; los ascorbatos en relación con el color y los demás con respecto al pH, textura y en ciertos casos aroma. Los adyuvantes también pueden afectar a la sanidad del producto.
El término de "curado" se utiliza mucho en varias industrias siempre en relación con un cambio deseable, por ejemplo en la preparación de cuero, fabricación de acero, endurecimiento de mortero y también en la conservación de alimentos. Sin embargo, incluso en la industria de los alimentos, la denominación de curado se relaciona únicamente con ciertos productos cárnicos y de pescado y con los quesos.  Hasta en estos alimentos la palabra "curado" puede tener distintas connotaciones: a la carne se le adicionan siempre sal y nitrito o nitrato; al pescado, también se le añade siempre sal, mientras que el nitrato se le adiciona en muy raras ocasiones y en el queso, que siempre contiene sal y rarísimamente nitrato, el término curado se aplica a la producción de cambios proteolíticos y lipoliticos deseables. De hecho el significado de "curados", incluso en la industria de los alimentos depende de la costumbre; por ejemplo, tanto la mantequilla como ciertas hortalizas adobadas necesitan sal como parte de su sistema conservador, pero nunca se les denomina productos curados. Las sales del curado, los adyuvantes y los procesos con ellos relacionados, ya citados, modifican el alimento base; entre tales modificaciones se incluyen las del color, aroma, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano; éste, dependiendo del producto, puede ser deseable, causar alteración u originar una toxiinfección alimentaria.



La historia del curado comenzó hace miles de años cuando el hombre aprendió a conservar la carne por salazón. La presencia de nitrato en la sal común es responsable del enrojecimiento de este alimento. Sin embargo, el nitrato como tal se utilizaba incluso antes de la era cristiana en las antiguas civilizaciones de China e India. Los escritores romanos describen el curado de la carne por salazón, ahumado y acidificación.  Hacia finales del siglo XIX se sabía que las bacterias reducían el nitrato a nitrito durante el curado de la carne y que el responsable del enrojecimiento era el nitrito y no el nitrato. Sin embargo, hasta 1923 no se permitió en EEUU la adición de nitrato a la carne. Actualmente en la mayoría de las carnes curadas se tiende a emplear solamente sal y nitrito, si bien en ciertos productos se utilizan todavía el nitrato o las mezclas de nitrato y nitrito.



El nitrato se ha empleado en Europa desde hace unos ciento cincuenta años en la elaboración de quesos salazonados mediante inmersión en salmuera. La concentración de cada uno de los agentes del curado depende de la naturaleza de los alimentos y de la tecnología empleada en cada país; en donde se dispone de refrigeración suficiente los productos cárnicos más corrientes son los ligeramente salados que necesitan mantenerse en refrigeración. Por el contrario, en climas cálidos y en donde no se dispone de suficiente refrigeración los productos más corrientes son los fermentados e intensamente salados (autoestables). En consecuencia los productos curados reflejan las economías y climas nacionales, constituyendo parte de las culturas nacionales y hasta regionales. De aquí que haya amplias diferencias entre los embutidos curados preparados en países distintos. Una afirmación similar puede hacerse para el pescado y quesos curados. No obstante, el resto de este capitulo se dedicará fundamentalmente al curado tal y como se aplica a la carne. Las carnes curadas pueden dividirse, de forma bastante amplia, en tres grupos: sin calentar, calentadas ligeramente (pasteurizadas hasta una temperatura en su centro de 65 – 75º C) y tratadas a temperaturas altas (autoestables, después de un calentamiento de l00 – 120º C).


En general sólo unos pocos productos sin calentar (ciertos tipos de jamón y embutidos, bacon y costillar ligeramente salado) necesitan almacenarse en refrigeración, mientras que la mayoría de los calentados ligeramente deben someterse a refrigeración después de tratados por el calor; sin embargo, los que se someten a temperaturas altas en climas templados y en recipientes herméticamente cerrados son indefinidamente estables. Cuando se incorpora nitrito a un sistema alimentario se suceden una serie compleja de reacciones cuya naturaleza depende de las características físico-químicas del sistema. Se desconocen muchas de las reacciones. El nitrito adicionado a la carne se convierte en una mezcla en equilibrio de NO-3, NO2 y NO, dependiendo del pH y del Eh. El nitrito desaparece como resultado de sus reacciones químicas con los componentes de la carne o de la actividad metabólica de los microorganismos. En las reacciones con la carne pueden estar implicados los pigmentos hemo, las proteínas no hemo y otros compuestos. Del 70 al 80 % aproximadamente del nitrito adicionado a la carne puede recuperarse en los siguientes porcentajes: nitrato 1-10; nitrito 5-20; gas 1-5; productos de su reacción con la mioglobina 5-15; id. con las proteínas 20-30; con el grupo sulhidrilo 5-15 y con los lípidos 1-5.



Unos pocos componentes de la carne (cisteina e histidina) y los aditivos ascorbato e isoascorbato parece que son los responsables de las pérdidas mayores de nitrito; los agentes reductores median en la conversión del nitrito en óxido nítrico, pero se desconoce el papel de la histidina. Parte del nitrito se convierte en nitrato mediante diversas reacciones químicas especialmente en presencia de ascorbato y en curaciones prolongadas, con tal que exista oxígeno o algún otro aceptor adecuado de hidrógeno. Si el nitrito de los productos enlatados esté en cantidades excesivas, durante el tratamiento térmico puede dar lugar a la liberación de óxidos de nitrógeno gaseosos que pueden causar abombamiento. La velocidad a que desaparece el nitrito de los productos cárnicos tratados por el calor depende del pH y de la temperatura; a medida que desciende el pH y sube la temperatura se acelera la velocidad a que desaparece. Por ejemplo la vida media en horas a un pH de 6 y a varias temperaturas será: a 100º C, 1,8; a 77º C, 6,7; a 24º C 126 y a 7º C 376 hs. Algunos microorganismos también contribuyen a la desaparición del nitrito al utilizarlo como aceptor de hidrógeno. Las levaduras y las bacterias pueden llevar a cabo esta operación en las carnes curadas envasadas al vacío en plásticos impermeables al oxígeno; el desarrollo de ciertas bacterias reductoras del nitrito persiste en este ecosistema hasta que se agota todo el nitrito. En la carne curada enlatada el nitrato sirve de aceptor de hidrógeno de las bacterias aerobias,por ejemplo Bacillus spp y micrococos; generalmente en ausencia de aquél no se multiplican. La reducción microbiana del nitrato o del nitrito a N2O y N2 puede producir abombamiento.



Los principales agentes del curado y adyuvantes que afectan al aroma son la sal, el azúcar, el humo y el nitrito. El azúcar se utiliza en bastante cantidad en ciertos tipos de bacon y jamones pero su contribución al aroma en otros productos es todavía objeto de controversia; el humo, como aromatizante, se estudiará más tarde. El nitrito reacciona con los componentes de la carne, especialmente de la de cerdo, modificando su aroma y este aroma modificado se acepta más que el de la carne de cerdo curada exclusivamente con sal.  La concentración óptima oscila entre 15 y 150 ppm de nitrito,dependiendo del producto. Se desconoce el fundamento químico del aroma del curado a pesar de las numerosas investigaciones realizadas, pero se ha sostenido la hipótesis de que parte del aroma a curado se debe a la ausencia de productos de la degradación oxidativa de los lípidos insaturados, por ejemplo hexanal y aldehido valérico. La sal y el hierro aceleran la oxidación y ésta es más rápida en la carne de cerdo que en la de bóvidos ya que posee más lípidos insaturados que la última. El nitrito retarda la velocidad de la oxidación; por lo tanto la diferencia entre la carne con y sin nitrito estriba en que en la primera la oxidación de los lípidos es menor. Se han hecho algunos trabajos con salchichas frankfurt de cerdo y de vacuno elaboradas con y sin nitrito que apoyan esta afirmación: las fabricadas con carne de cerdo sin nitrito o con niveles de nitrito bajos fueron organolépticamente menos aceptables que las de vacuno. Las especias y el ahumado pueden mejorar la aceptación organoléptica de los productos elaborados sin nitrito.



En la carne que ha sido tratada por el calor y refrigerada se ha observado un defecto conocido como "aroma a sobrecalentado" ("warmed over" flavor (WOF)). Se debe al aumento, favorecido por el hierro, de los lípidos oxidados tales como heptanal,n-nona-3,6-dienal y otros compuestos semejantes. El nitrito previene o disminuye la producción de WOF, defecto qúe también se evita al producirse antioxidantes durante un calentamiento intenso o adicionando algunos antioxidantes como: hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) y galato de propilo. Todo ello está en favor de la hipótesis de que el aroma a curado se debe, al menos en parte, a la inhibición de la oxidación de los lípidos.  La adición de nitrito a la carne transforma los pigmentos cárnicos, en especial la mioglobina y en menor extensión la hemoglobina, en un pigmento rojo,insoluble en agua, la oxido nítrico mioglobina. El calentamiento transforma este pigmento en otro rosa, el nitrosil-hemocromo que se estabiliza con los ascorbatos. Los pigmentos de carne curada pueden originarse por reacciones químicas, bioquímicas o enzimáticas, dependiendo de que se caliente la mezcla carne-nitrito y del tiempo transcurrido entre la adición de nitrito y el calentamiento. La reacción del curado la aceleran el pH bajo, las condiciones reductoras y las temperaturas altas; en condiciones óptimas la adición de 15 ppm de nitrito sódico produce el máximo color en los productos picados y emulsionados y unas 50 ppm dan el máximo color al bacon de los flancos.



Estas concentraciones de nitrito tienen escaso o ningún efecto antibacteriano; las bacterias no ejercen otro papel fundamental en la producción del color salvo reducir el nitrato a nitrito y en ciertos productos bajar el Eh y el pH. El Eh desciende también bajo la acción del calentamiento y del ascorbato y el pH bajo el efecto de la glucono-d-lactona y del pirofosfato ácido de sodio.  La reacción principal parece ser la formación de un intermediario nitroso reductor entre el nitrito y los diversos agentes reductores y la escisión del intermediario para liberar óxido nítrico. Entonces el óxido nítrico producido reemplaza al agua unida al hierro en la porción hemo de la mioglobina o hemoglobina. En la carne hay muchas reacciones que compiten por los ascorbatos. Los ascorbatos tienen interés como aceleradores del desarrollo y estabilizadores del pigmento de la carne curada. Influyen además en la actividad anticlostridial del nitrato en las carnes pasteurizadas enlatadas, cuyo efecto aumenta si existe una proporción adecuada de ascorbato o disminuye cuando su concentración es excesiva.  Sus principales efectos beneficiosos en las interacciones quimicas que tienen lugar en las carnes curadas son: (1) como agentes reductores y (2) como quelantes. Los ascorbatos como agentes reductores actúan como consumidores de oxígeno; disminuyen el Eh; participan en la reducción de la metamioglobina a mioglobina; reaccionan con el nitrito para aumentar la producción de óxido nítrico que reacciona entonces con la mioglobina para dar óxido nítrico rnioglobina.  Los ascorbatos secuestran a prooxidantes tan activos como el cobre y el hierro; la quelación del hierro puede ser una de las razones por las que aumenta la actividad antibotulínica del nitrito.


 



i. RADIACIONES IONIZANTES EN ALIMENTOS

Entre el conjunto de radiaciones potencialmente utilizables para su aplicación en los alimentos, es necesario distinguir dos categorías diferentes. La primera, es la radiación de frecuencia relativamente baja y de longitud de onda más larga que la de la luz visible, aproximadamente de 107 a 1010 Hz* (*Hz = Hertz, 1 Hz = 1 ciclo por segundo; frecuencia (en Hz) n longitud de onda (en metros) = 3 n 10), o sea,las que van desde la onda corta de la radio (10 megaciclos) pasando por la longitud de onda del radar, e incluyendo los infrarrojos aproximadamente 1012 - 1014 Hz.  Estas radiaciones poseen un bajo poder energético y por lo general su acción sobre las moléculas produce frotamiento con elevación térmica. A pesar de algunos trabajos en los que se señala una acción específica sobre los microorganismos, la mayoría de los publicados indican que los efectos letales para los mismos, sólo se debe a dicho calentamiento,por lo que no se toman en consideración en este lugar. En la segunda categoría, están las radiaciones de longitud de onda más corta que las de la luz visible, con frecuencias de aproximadamente 1015 Hz o más, las cuales poseen el suficiente poder energético para excitar o modificar las moléculas orgánicas y por tanto son capaces de desarrollar una acción letal específica. Las radiaciones de más baja frecuencia y energía, en la zona ultravioleta (UV) del espectro, sólo son capaces de excitar a las moléculas y son las que se van a estudiar en este capítulo. Aquellas otras de más alta frecuencia, desde 1018 Hz y más, tienen la suficiente energía para romper las moléculas en partes con cargas distintas llamadas iones y a estas radiaciones se les llama “Ionizantes”.



La zona UV del espectro se extiende por debajo de la longitud de onda de 450 nm. La longitud de onda más eficaz para la destrucción de microorganismos está alrededor de 260 nm. con un cuanto de energía aproximadamente de 4,9 electrón voltios (eV). Longitudes de onda inferiores a 200 nm. no son eficaces porque se absorben muy rápidamente por el oxígeno atmosférico. Las longitudes de onda desde 360 a 450 nm. se les suele llamar "onda larga ultravioleta", "luz negra" o "ultravioleta próxima". Se utilizan frecuentemente para producir fluorescencia, así por ejemplo, para demostrar la presencia de pigmentos de Pseudomonas en huevos, mediante lámparas ultravioletas. Estas ondas atraviesan fácilmente el cristal y tienen efectos limitados sobre los microorganismos. Las radiaciones ultravioletas se encuentran en algunas fuentes luminosas de temperatura alta por ejemplo, en la luz solar o en lámparas de arco voltaico), y en ciertos tubos fluorescentes. En la práctica, la fuente habitual de UV es la lámpara de vapor de mercurio de baja presión, que emite varias longitudes de onda específicas, algunas de luz visible, pero alrededor del 80 % del total, es emisión UV a 254 nm., la cual tiene sólo el 85 % de la actividad biológica que correspondería a los 260 nm.  Esta lámpara debe estar construida con un cristal especial que absorba las radiaciones por debajo de 200 nm. las cuales, si son absorbidas por el oxígeno atmosférico, producen ozono, lo que no es conveniente. Las lámparas de mercurio de alta presión que se utilizan para la iluminación, tienen poco poder germicida. Están empezando a utilizarse ahora, las lámparas láser activadas, de mucho más rendimiento.



La intensidad de irradiación* (*irradiación es el proceso por el que se aplica energía radiante sobre un objeto, tal como un alimento), se mide por la energía absorbida por la unidad de superficie, generalmente en ergs/seg µW/cm2 (107 ergs/srg = 1 vatio). Una lámpara de vapor de mercurio a baja presión de 50-vatios proporciona una intensidad efectiva de aproximadamente 100 µW/cm2 a una distancia de 1 m. La "dosis" de irradiación absorbida se mide por la energía total (o sea, que con una intensidad dada, el producto del tiempo por la intensidad, como se ha definido más arriba) expresada como ergios o µW seg/cm2. Las dosis utilizadas contra los microorganismos, por encima de 105 µW por seg., representan cantidades de energía demasiado pequeñas para producir una elevación significativa de la temperatura (4.2 · l07 ergs = 1 caloría).   Debido a su bajo cuanto de energía, la irradiación UV es totalmente absorbida por las moléculas expuestas. La molécula se excita por la energía absorbida y puede suceder entonces que se produzcan reacciones anormales que provoquen su destrucción, con posibles efectos letales sobre los gérmenes. Existe una absorción marcadamente preferente por determinadas sustancias, como por ejemplo, por los ácidos nucleicos.



La longitud de onda con efectos más letales, alrededor de los 260 nm., es la que en su mayoría se absorbe por las bases de los ácidos nucleicos y existen numerosos datos que indican igualmente que los ácidos nucleicos son el blanco principal de la radiación UV. Sin embargo, por lo que se refiere a los alimentos, es igualmente absorbida al instante por varias sustancias de importancia. Ya se ha señalado la absorción por el oxígeno de las longitudes de onda más cortas. La absorción por el agua está en razón de su transparencia, en el agua pura, la intensidad de absorción se reduce aproximadamente dos tercios por cada 5 cm. de profundidad, pero en agua de río, se absorben dos tercios de energía solamente en 1 cm. de profundidad.  Su actividad se ve también afectada por determinados iones, como por ejemplo, Fe+++. Proteínas y bases también absorben la radiación UV de manera importante, así que en la leche, por ejemplo, una capa de aproximadamente 0,1 mm. de espesor es capaz de absorber el 90 % de la energía incidente. La absorción es aproximadamente proporcional a la concentración de las sustancias citadas, aunque puede decirse que la penetración es siempre menor en los alimentos sólidos. Puesto que la penetración de la radiación UV es pequeña en los líquidos e insignificante en los alimentos sólidos, su principal aprovechamiento reside en la destrucción de microorganismos suspendidos en el aire o que se encuentren sobre las superficies. Sin embargo, los gérmenes pueden ser también resistentes si se encuentran cubiertos por capas de sustancias protectoras, tales como aerosoles o sobre superficies húmedas o de alimentos grasos.



La intensidad de radiación de distintas longitudes de onda, se puede medir por métodos físicos, pero no se conoce un método sencillo para determinar la dosis efectiva, la cual se debe apreciar teniendo en cuenta el tiempo y la distancia de una determinada lámpara. Son confusos los intentos para medir directamente los efectos sobre los microorganismos, debido a la gran influencia de los factores extrínsecos e intrínsecos.  Cuando una población uniforme de células microbianas, esporos, o conidios se irradia a una intensidad constante, el número de supervivientes disminuye exponencialmente con el tiempo (o sea, con la dosis total de la radiación aplicada). De aquí se deduce que conviene expresar la resistencia de una especie de microorganismos, como la dosis necesaria para reducir el número de supervivientes a un décimo (esto es, 90 % de letalidad), una cantidad que es virtualmente independiente del número absoluto de microorganismos implicados y de la clase de dosis.  Esta cantidad, como sucede en situación semejante con el tratamiento por el calor, se la puede llamar valor D o "dosis de reducción decimal", Valores D específicos son: Serratia marcescens, 1500 µW seg; Escherichia coli, 2000 µW seg; esporos de Bacillus mesentertcus, 10.000 µW seg. Para establecer cada valor D con la radiación UV, se necesita mucho más cuidado que con las radiaciones ionizantes, hay que tener en cuenta la absorción de la radiación por el medio, como se ha indicado anteriormente. El valor D depende también de la fisiología y otras características específicas de las células.



Existe una falta de información precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiación UV. Diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta, y la comparación de los datos obtenidos por técnicos diferentes, dan lugar a errores, por haber trabajado con condiciones de irradiación no superponibles, distinta edad de los microorganismos, etc. Consecuentemente, existen discrepancias manifiestas en la literatura disponible. Hablando de una manera amplia, se ha afirmado que los bacilos no esporulados gram-negativos son los que se destruyen más facilemtne con la radiación UV; los estafilococos y los estreptococos necesitan una dosis aproximadamente cinco veces mayor; los esporos bacterianos alrededor de 10 veces; las esporas de los hongos (sin agua) alrededor de 50 veces, y los virus todavía más. La mayoría de las bacterias gram positivas y los esporos son menos resistentes que lo señalado en estas indicaciones de tipo general. No obstante, en términos amplios, el orden de resistencia a la radiación UV entre las bacterias, guarda cierta semejanza con el que presentan a las radiaciones ionizantes. Esto es bastante diferente en otras agrupaciones más heterogéneas; así las levaduras son aproximadamente tan resistentes como las bacterias a la radiación UV, mientras que los hongos lo son todavía mucho más;con las radiaciones ionizantes sucede todo lo contrario. La radiación UV de la clase e intensidad descritas aquí, durante su utilización práctica, posee un peligro inmediato para los obreros, para su piel y especialmente para sus ojos. Son esenciales los exámenes periódicos y/o las limitaciones en el tiempo de exposición. Mientras que se ha divulgado mucho aquéllo que se refiere a los efectos mutagénicos de las radiaciones ionizantes, poco se ha dicho sobre el peligro de tales mutaciones cuando se utillízan radiaciones UV, quizás se debe a que una larga experiencia sin precauciones especiales, y sin efectos nocivos, ha demostrado que el riesgo es insignificante. Si la lámpara ultravioleta produce una emisión por debajo de 200 mn., existe la posibilidad de que se produzca ozono, el cual, favorece además la oxidación de las grasas, siendo tóxico para el hombre en concentraciones no detectables aún por su olor.



El mayor valor del tratamiento con radiaciones UV se encuentra en el saneamiento del aire, por lo que se utiliza ampliamente con ese objeto. También puede aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos.  En los laboratorios de microbiología de los alimentos, las lámparas ultravioleta se utilizan para esterilizar el aire en aquéllas zonas que contienen cultivo,este uso puede tener un valor especial, cuando las condiciones industriales producen atmósferas fuertemente contaminadas. Igualmente, la luz UV puede servir para controlar en las panaderías el crecimiento sobre el pan de las esporas de los hongos, o para el control de la propagación de los microorganismos en la superficie, pero no en el interior, de los pasteles de crema.  En jarabes de azúcar concentrados contenidos en depósitos grandes, por otro lado microbiológicamente estables, la condensación en la zona superior tiende a que la concentración de azúcar se diluya y sea menor en la superficie del jarabe, lo que permite en la misma, el crecimiento de los hongos que se encuentran en el aire. Esto se puede prevenir instalando lámparas UV sobre la zona superior de los depósitos. Debido a la limitada penetración de la radiación UV, los líquidos se deben exponer en capas delgadas para facilitar su absorción. Aunque en principio, la luz UV es excelente para el tratamiento del agua, la necesidad de exponerla solamente en capas no mayores de 1 cm. de grosor, da lugar a que el equipo sea complejo y costoso, teniéndose además que clarificar primero el agua. 



Para destruir una cifra importante de microorganismos, se necesitan tiempos de exposición relativamente largos, así que el rendimiento es bajo. Estas limitaciones hacen este procedimiento menos práctico que la cloración. Para el tratamiento de la leche se necesita exponerla en capas muy finas bajo la fuente de irradiación, haciendo que el control sea difícil y el rendimiento muy bajo. Este tratamiento facilita la oxidación de la grasa y la formación de olores anormales. Por ésto, aunque en condiciones apropiadas se puede reducir el número de bacterias en 90 – 99 %, el procedimiento no tiene valor práctico. La irradiación ultravioleta puede efectivamente destruir los microorganismos de una superficie, por sólo si la superficie previamente se ha limpiado bien y si ha sido sometida a la exposición un tiempo suficiente. Es normal, que sólo estas superficies irradiadas directamente así, se sanean, porque incluso el cristal corriente es relativamente opaco a las longitudes de onda germicidas. La irradiación ultravioleta se puede utilizar para esterilizar envases donde otros métodos como el calor, no se pueden aplicar. Generalmente los envases deben estar abiertos para permitir que penetre la irradiación, como por ejemplo, en el tratamiento del material utilizado para los envases de llenado aséptico de la leche uperizada (UHT). Sólo si el material es transparente para la radiación UV como por ejemplo, algunas bolsas de plástico delgado, se puede tratar el interior sin abrir el envase. 



El azúcar utilizado en las conservas puede contener esporos termófios, los cuales son difíciles de destruir, excepto por radiaciones UV.  Aproximadamente 10 esporos de Bacillus stearotermophilus por gramo de azúcar se pueden destruir con una exposición de unos 30 minutos, actuando sobre capas de azúcar de 4 mm. de espesor, esta penetración quizás esté ayudada por reflexiones múltiples de las superficies de los cristales.  El tiempo de exposición se puede acortar si la capa de azúcar se remueve, pero se alarga mucho si el azúcar tiene terrones. El azúcar se altera poco por la luz UV. Otra aplicación en la industria alimentaria, es en las cámaras de refrigeración utilizadas para almacenamiento de la carne con objeto de impedir el crecimiento de microorganismos en la superficie. La disminución de la contaminación procedente del aire parece ser poco importante.  Aunque la energía que se aplica actualmente a la superficie de la carne es más bien baja, y los microorganismos son numerosos e íntimamente incrustados en ese substrato protector, existen sin embargo datos frecuentes asegurando que su utilización permite aumentar el tiempo de almacenamiento. Se puede decir de forma general, que los microorganismos se ven afectados, solo cuando la exposición a la radiación ultravioleta incide directamente sobre estas superficies sólidas. Sin embargo, la producción de ozono o la reflexión de los rayos UV pueden tener un efecto menor sobre los microorganismos que se encuentran sobre superficies no directamente expuestas.



El problema a resolver aquí, no obstante, no es la esterilización, sino más bien el frenado de la multiplicación microbiana; en este caso la radiación se aplica de una forma continuada. Con un microorganismo multiplicándose a razón de 10 escisiones en un periodo de 104 - 105 seg. aproximadamente, y a una dosis de reducción decimal de 10 - 103 µW seg.  En efecto los periodos de frenado son así más largos, los factores de crecimiento más bajos, y el máximo de concentración celular más pequeño, incluso con intensidades de irradiación tan bajas se consiguen estos efectos en la superficie de la carne. Por ejemplo, sometiendo carne que contiene Pseudomonas causantes de alteración a irradiación UV, se reduce su factor de crecimiento al 85 % aproximadamente, comparando con una carne testigo no irradiada y utilizando una intensidad en la superficie de 2 µW/cm2 y de 24 µW/cm2 para aproximadamente el 75 %. Para retrasar la reproducción en la superficie de la carne de los hongos procedentes del aire, es suficiente con una intensidad de 0,2 µW/cm2 e igualmente eficaz para restringir la propagación de colonias bacterianas. Lo anterior se consigue actuando a 0º C y en una atmósfera semisaturada [equilibrio de la humedad relativa (EHR) 0,993]; con un EHR de 0,985 se redujo más el crecimiento. La apariencia de mejoramiento fue mayor de lo que realmente se había conseguido, debido a que la irradiación actuó eliminando sólo el crecimiento de la superficie de la carne. Una intensidad de 2 µW/cm2 detuvo la formación de las hifas de los hongos, y 24 µW/cm2 relegaron el crecimiento bacteriano a las zonas capilares por debajo de la superficie de la carne. Las colonias formadas fueron difícilmente visibles y muchas de las bacterias desarrolladas tenían formas largas filamentosas.



El costado "iluminado" de una canal situada a 2 m. de una lámpara sencilla de 25 vatios, puede absorber una intensidad aproximada de 0,2 µW/cm2, dosis que puede ser significativa, e incluso se puede incrementar esta dosis si la habitación tiene paredes con superficies reflectantes. La eliminación de los olores de la alteración por la radiación UV puede engañar al comprador, haciéndole creer que el alimento está fresco y en buenas condiciones. Este efecto no podría conseguirse por la introducción, en su lugar, del ozono. La radiación ultravioleta es inadecuada para su utilización en ciertos alimentos ricos en grasas, especialmente grasas insaturadas, puesto que acelera enormemente la formación de olores a rancio debido a su fuerte acción catalítica sobre la oxidación de los lípidos. Por ésto, debe restringirse su utilización con productos lácteos, y es mucho más eficaz en las cámaras de refrigeración, para tratar carne de cordero o de vaca que para la de cerdo. La radiación UV produce daños en verduras, formando manchas decoloradas en las hojas. Existen algunos datos que afirman que la radiación UV tiene menos efecto sobre microorganismos en substrato seco que sobre aquéllos que se encuentran en medio húmedo, pero experiencias efectuadas con microorganismos suspendidos en el aire a diferentes humedades relativas, puede que no hayan tomado en cuenta los efectos "clumping", existiendo por ésto, gran discrepancia en el asunto. Se ha señalado que la resistencia en "seco es mas de diez veces superior, comparada con la de atmósferas húmedas, y existen informes sobre un cambio relativamente repentino en la resistencia con humedades relativas cercanas al 60 %. 



No se conoce información en este caso sobre lo que afecta a los alimentos. La temperatura, dentro de la escala normal de 0ºC a 40ºC, apenas tiene efecto sobre la sensibilidad para las radiaciones UV. Microorganismos expuestos a la radiación UV se muestran después más sensibles al calor y viceversa, como ocurre también con las radiaciones ionizantes. Los efectos letales de la radiación UV, a diferencia de los de la radiación ionizante, no se incrementan mucho con la presencia de oxígeno. Como la radiación ionizante, la ultravioleta, inhibe la división celular antes de que alcancen el tamaño adecuado; por ésto, las dosis subletales dan lugar a la formación de células filamentosas, las cuales más tarde o reanudan la división celular normal o mueren. Las condiciones que se presentan después de la irradiación tienen una gran influencia en la recuperación de las células irradiadas. Aunque el tema es extenso, poco ha sido lo que se ha encontrado importante para su aplicación en los alimentos; lo más digno de tenerse en cuenta son los efectos revitalizadores de la luz visible ("fotorreactivación") y las indicaciones de que la recuperación de la facultad de crecer tiene lugar mejor en medios sencillos y a temperaturas por debajo de las consideradas como óptimas.  Existe además, otro tipo de radiación ionizante que se caracteriza por poseer un alto contenido de energía, gran poder de penetración, y acción letal debida a su liberación a nivel celular. 



Hasta hace poco, las aplicaciones principales de la radiación ionizante han sido en el campo de la medicina, en técnica industrial y como procedimiento para estudios genéticos, así como la función y estructura de los microrganismos. La aplicación práctica de la radiación ionizante para destruir microorganismos en productos comerciales (principalmente farmacéuticos) solo se ha desarrollado en las últimas dos décadas. La letalidad para los microorganismos de las radiaciones "alfa", ß, "gamma" y de los rayos X se conocía ya a principios de siglo. Con la excepción de los rayos X, los métodos para la producción de radiaciones ionizantes de una forma económica y controlada y teniendo la intensidad precisa para poderlas utilizar en la industria en gran escala, no estuvieron a punto hasta después de la Segunda Guerra Mundial, cuando los intensos estudios sobre la fisión atómica para fines militares, tuvieron como resultado una más amplia y clara comprensión de las fuentes y de los orígenes de la radiación ionizante, además de una gran acumulación de conocimiento técnico en este campo. La atención pública se concentró en los usos pacíficos de la energía atómica, y trabajos sobre la conservación de los alimentos por este procedimiento, se iniciaron en varios países durante la pasada década del 50 y han continuado desde entonces con intensidad variable. Inicialinente, sólo se interesaron los pocos países que poseían tecnología atómica, como Estados Unidos, el primero en este campo, pero en los últimos años, el interés sobre la irradiación de alimentos se ha extendido a muchos otros países.



Los primeros trabajos establecieron claramente la utilidad en potencia de la irradiación como un procedimiento de conservación de los alimentos e indicaron desde un punto de vista práctico, que los dos mejores métodos utilizables, serían un dispositivo-generador de electrones (radiación ß) y las radiaciones y originadas en la desintegración de isótopos radiactivos (como el 60Co) formado como un subproducto en el funcionamiento del reactor. Durante la década de 1960 algunos Gobiernos permitieron la utilización de la radiación ionizante para tratar un número limitado de alimentos. Posteriormente, esta autorización fue anulada en Estados Unidos, debido a que los trabajos de experimentación, indicaron que la irradiación podría inducir a la formación de compuestos potencialmente mutagénicos, teratogénicos, o cancerígenos, en determinados alimentos. Investigadores de varios países, están estudiando la inocuidad de diversos alimentos irradiados en experiencias con animales, por tests de mutagenicidad sobre células y de teratogenicidad (mutaciones letales) con extracto del producto. Por el momento, los resultados confirman la inocuidad del procedimiento, y parece probable que la irradiación podría aprobarse de nuevo como un método de tratamiento de los alimentos.  La literatura de los efectos de la radiación ionizante sobre los microorganismos es amplia y en este capítulo solo pretendemos el estudio de aquéllos hechos importantes para el microbiólogo y que se refieran a los productos alimenticios.



La radiación ionizante presenta algunas ventajas en comparación con otros procedimientos en lo que se relaciona con la destrucción de bacterias en los alimentos:

1. Es altamente letal, pero la dosis puede ajustarse para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes.
2. A niveles bajos (< 0,5 Mrad), no produce cambios organolépticos detectables en el producto.
3. Incluso con dosis altas (> 1 Mrad) son pequenos los cambios químicos totales producidos en el alimento.
4. No deja residuos que no pertenezcan al alimento.
5. Se produce muy poco calor, por lo que los productos crudos mantienen las características del alimento fresco, pudiéndose incluso tratar los alimentos previamente congelados.
6. La penetración de la radiación es instantánea, uniforme y profunda, permitiendo un control preciso del procedimiento (en contraste con el calor).

Existen no obstante ciertos inconvenientes:

1. Normalmente no son inactivados los enzimas cuando se utilizan dosis bactericidas, por lo que pueden permanecer activos en los alimentos durante el almacenamiento.
2. Los cambios químicos, aunque pequeños en su totalidad, pueden dar lugar a alteraciones organolépticas inaceptables en ciertos alimentos sensibles o en alimentos que se han sometido a dosis altas. Estos cambios se asocian generalmente con la presencia de radicales libres, los que a su vez pueden actuar también como un factor bactericida secundario.
3. Algunos estudios han sugerido que la irradiación de alimentos puede inducir a la formación de factores mutagénicos, teratogénicos, cancerígenos o simplemente tóxicos, aunque juicios recientes y autorizados, sugieren que tales afirmaciones eran muy infundadas (Comité de Expertos FAO/OIEA/OMS, 1977).
4. Las dosis utilizadas para destruir microorganismos son varias veces superiores que las precisas para matar a un hombre y por lo tanto deben tomarse medidas de seguridad muy estrictas para proteger a los obreros y a los manipuladores de alimentos. Esto obliga a utilizar una fuerte protección alrededor de la fuente radiactiva y a controlar continuamente al personal y a la zona de trabajo.



La radiación a los niveles de energía utilizados para los alimentos (< 2 MeV) no producen radiactividad inducida. Sin embargo, puede producirse radiactividad inducida con radiaciones de alta energía que pasen de 10 MeV, lo que resulta impropio para el tratamiento de alimentos. Las radiaciones ionizantes se caracterizan por atravesar instantaneamente la materia estando en relación este dato con la clase de radiación y la densidad del material a tratar. Para una energía determinada, la radiación gamma es mucho más penetrante que los electrones. La radiación ß con energía de 3 MeV tiene una capacidad de penetración en el agua de 1 cm aproximadamente y se comporta de forma semejante en alimentos líquidos o sólidos de una densidad similar, mientras que la radiación y con energía de 1,1 MeV procedente del 60Co penetra en un alimento alrededor de 20 cm pero sin embargo la frena una plancha de plomo de parecido grosor. Con ambas clases de irradiación, simultáneamente, es posible conseguir una absorción lo suficientemente uniforme para que llegue a todos los puntos de un alimento que sea aproximadamente el doble de grueso. Además, estableciendo una "geometría" adecuada y normalizando las formas, la distribución de la dosis por todas las partes del alimento puede llegar a ser casi uniforme. Cuando el daño molecular tiene lugar en una parte vital de una célula viva, esta célula muere, y existe una gran evidencia que indica que ocurre esto en la alteración del núcleo o el material nuclear. En una pequeña proporción de casos la alteración da lugar a una mutación. Los organismos mayores mueren con dosis de radiación ionizante mucho más pequeñas, por tanto, cuando se utilizan dosis de 100 Krad con objeto de destruir bacterias, la radiación debe actuar de forma que no pueda llegar hasta los operarios.

La dosis se mide normalmente mediante dosímetros, mientras que la fuente se regula con monitores en cámaras de ionización modificadas. Los dosímetros que se utilizan más corrientemente son cristal de cobalto, sulfato ferroso, o sulfato ceroso. El cristal de cobalto cambia de color proporcionalmente a la dosis que recibe. Las sales ferrosas y cerosas son oxidadas a sales férricas o céricas como resultado de la interacción con radicales hidroxílicos producidos por la radiación del agua.  En un paquete con alimentos expuesto a una fuente de radiación ionizante, la distribución de la dosis no puede ser uniforme. Se encuentra comúnmente unas variaciones entre 100 y 125 % y esto se debe conocer anticipadamente para calcular el tratamiento a que tienen que someterse los alimentos. El cálculo de la dosis letal para los microorganismos está en relación con el número de supervivientes y los cálculos matemáticos son en cierto modo similares a los utilizados en el tratamiento térmico.  La muerte de los microorganismos es una consecuencia de la acción ionizante debida a la radiación de alta energía. La mayoría de los estudios indican que una causa primordial de letalidad es la alteración sufrida por el ADN microbiano, lo que da lugar a una pérdida de la capacidad reproductora, pero la alteración de otras moléculas sensibles e importantes (en las membranas) puede tener lugar también. Las dosis letales para los microorganismos no inactivan a la mayoría de los enzimas, ni tienen lugar cambios importantes en las proteínas y otras moléculas grandes.



Se forman radicales libres y otras moléculas reactivas, particularmente en el agua, aunque no está claro hasta donde llega la ionización primaria ("golpes directos") y hasta donde los efectos secundarios como responsables de las alteraciones letales en los microorganismos. En los alimentos irradiados, la alteración subletal puede impedir la revitalización de ciertas bacterias. Los microorganismos difieren mucho en lo que se relaciona con su sensibilidad a la irradiación. En sentido general la muerte de microorganismos de poblaciones expuestas a las radiaciones ionizantes es de naturaleza logarítmica. Por tanto, si un cultivo o una suspensión de una cepa pura de un microorganismo se expone a la acción constante de la irradiación ionizante letal, una fracción constante de la población microbiana morirá a intervalos de tiempo iguales, con independencia del número total. En la práctica, esto significa, que un gráfico del logaritmo de los supervivientes frente a las dosis, es una línea recta en casi toda su longitud.  En algunos casos puede aparecer al comienzo de la curva un pequeño "hombro". Esto puede deberse a fenómenos no relacionados con la sensibilidad real a la irradiación de los microorganismos, como puede ser la agrupación de células, o a que existen por lo menos dos zonas sensibles en la célula, las cuales es necesario que se inactiven antes de que dichas células pierdan su viabilidad.



Desde el punto de vista matemático, la situación es semejante a la muerte producida por calentamiento, y el valor D (tiempo de reducción decimal) concepto de los termobacteriológicos, se aplica igualmente a la muerte por irradiación. El valor D, se define como la dosis necesaria para reducir la población microbiana a una décima parte (log 10 1). Luego un tratamiento 2D equivaldría a una dosis suficiente para reducir la población microbiana a la centésima parte. La resistencia de los microorganismos a los efectos letales de la irradiación, aumenta en ausencia de oxigeno, lo que sugiere que tienen importancia las reacciones de oxidación que se originan como consecuencia de la irradiación. También aumenta la resistencia de los microorganismos a la radiación ionizante en ausencia de agua.  En substratos completamente deshidratados, se requieren dosis 2 a 3 veces más altas para obtener efectos microbicidas equivalentes a las precisas en substratos hidratados, ésto se debe a que se aminora la ionización secundaria, así como también a los efectos de los radicales libres que se citan más adelante. Congelando, con lo que efectivamente se inmovilizan las moléculas de agua, se producen efectos protectores similares, debidos posiblemente a la inmovilización de las moléculas reactivas retenidas por la malla de cristales de hielo hasta que se deshacen. 



Debe señalarse que el efecto es menor en los esporos, presumiblemente debido al secuestro del agua en la estructura de los mismos. El sustrato influye en la sensibilldad a la irradiación. Por esto, pueden necesitarse dosis distintas para conseguir efectos microbicidas semejantes en alimentos diferentes. Además, los alimentos pueden producir condiciones anaeróbicas localizadas, incluso cuando el oxígeno está presente en el exterior, y esto puede influir de una forma importante en la resistencia a la irradiación. La sensibilidad a la radiación de los microorganismos difiere según las especies e incluso según las cepas, aunque las diferencias de resistencias entre cepas de una misma especie son generalmente lo suficientemente pequeñas para no tenerlas en cuenta a efectos prácticos. Las bacterias gram-negativas, incluyendo los microorganismos causantes de alteración de los alimentos (Pseudomonas) y las especies entéricas, incluyendo las patógenas (Salmonella, Shigella), son generalmente más sensibles a la irradiación que las bacterias gram-positivas. El estreptococo fecal es bastante resistente, los esporos bacterianos son todavía más resistentes, y el Micrococcus radiodurans es excepcionalmente resistente.








"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HABITO"

ARISTOTELES






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jueves, 17 de marzo de 2016

NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO de AGUAS y ALIMENTOS (III Parte)

“El médico del futuro no tratará el cuerpo humano con medicamentos, más bien curará y prevendrá las  enfermedades con la nutrición" 
(Thomas Alva Edison)



NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO 
de AGUA y ALIMENTOS (III Parte)





f. TEMPERATURA

El hombre ha aprendido a lo largo de los siglos, por vía empírica,a explotar las temperaturas extremas para la conservación de sus alimentos. Observó que enfriándolos se retrasaba su alteración; que manteniéndolos en estado congelado se conservaban durante largos periodos de tiempo; que el calentamiento eliminaba los agentes de la alteración de origen microbiano y que, si se evitaba la recontaminación mediante un envasado adecuado, los alimentos térmicamente tratados podían conservarse incluso a la temperatura ambiente.  Del mismo modo, averiguó que algunos alimentos, mantenidos a la temperatura ambiente, sufren modificaciones de sus propiedades organolépticas, pero siguen siendo aptos para el consumo y se tornan considerablemente más estables. Así se fue desarrollando una amplia variedad de alimentos fermentados, muchos de ellos asociados en su origen a una determinada raza y a los alimentos frescos localmente disponibles.  La sociedad moderna consume cientos de productos fermentados que, pese a que un buen número de ellos se han visto favorecidos por la aplicación de los conocimientos científicos, recientemente descubiertos, siguen siendo esencialmente idénticos a los que se consumían hace varias generaciones. 




Las fermentaciones generalmente implicadas son la láctica y la alcohólica, o una combinación de ambas. Si el alimento original contiene un azúcar fermentescible y se encuentra moderadamente salado es probable que se produzca una fermentación láctica Si su sabor es ácido,lo esperable es una fermentación alcohólica. En cualquier caso, para conseguir las características deseadas en el producto fermentado de que se trate, resulta esencial el control de la temperatura, generalmente un ambiente frío. A lo largo de milenios de la historia de la humanidad, sólo las dos o tres últimas generaciones han sido capaces de capitalizar para la conservación y las fermentaciones de los alimentos los principios científicos en que estos procesos se basan. El control y la manipulación de la temperatura se encuentran entre los factores más críticos precisos para el logro de un suministro alimenticio que reúna las propiedades sanitarias organolépticas correctas. En este capítulo describiremos los principios científicos relacionados con la explotación de la temperatura en el control de los microorganismos que de ordinario pueden encontrarse en los alimentos consumidos por el hombre. 



Probablemente sea la temperatura el más importante de los factores ambientales que afectan a la viabilidad y el desarrollo microbianos. Aunque el crecimiento microbiano es posible entre alrededor de -8 y hasta +90º C, el rango de temperatura que permite el desarrollo de un determinado microorganismo rara vez excede de los 37º C. Dentro de este rango, la temperatura afecta a la longitud de la fase de latencia, a la velocidad de crecimiento, al número final de células, a las necesidades nutritivas y a la composición química y enzimática de las células. Cualquier temperatura por encima de la máxima de crecimiento de un determinado microorganismo resulta letal para el mismo, y cuanto más elevada sea la temperatura en cuestión tanto más rápida será la pérdida de viabilidad. Sin embargo, la letalidad de cualquier exposición a una determinada temperatura por encima de la máxima de crecimiento depende de la termorresistencia que es fundamentalmente una característica del microorganismo considerado.



Los microorganismos sobreviven a temperaturas inferiores a la mínima de crecimiento. Los efectos letales de la refrigeración y la congelación dependen del germen considerado, del microambiente y de las condiciones de tiempo y temperatura de almacenamiento. Algunos microorganismos permanecen viables durante largos periodos de tiempo si se mantienen congelados a temperaturas suficientemente bajas. Tras un periodo de ajuste o adaptación al ambiente (fase de latencia) comienza el crecimiento que se acelera hasta alcanzar una etapa de multiplicación rápida y constante, de crecimiento exponencial, denominada fase logarítmica o exponencial. La defección de nutrientes y el acúmulo de metabolitos tóxicos termina frenando la velocidad de crecimiento hasta que alcanza un punto en el que muertes y divisiones celulares se igualan, permaneciendo así la población constante durante un periodo al que se conoce con el nombre de fase estacionaria. A esta fase en la que la población es máxima, sigue otra en la que va progresivamente decreciendo a causa de las muertes celulares.  La influencia de la temperatura sobre la actividad microbiana es más acusada en los alimentos húmedos, es decir a actividades de agua (aw) superiores a 0,85. La mayor parte de las bacterias son incapaces de seguir creciendo a actividades de agua inferiores. 

A las temperaturas más elevadas, hay un rango en el que la velocidad de crecimiento, tiempo de generación, se mantiene relativamente estable (óptimo de crecimiento); este rango se halla en torno a 20 – 30º C para los psicrótrofos y 35 – 45° C para los mesófilos. A temperaturas sólo ligeramente superiores a las que son precisas para un crecimiento óptimo se da una inhibición del mismo. Las bacterias termófilas responden de un modo similar, pero su gráfica de crecimiento se encuentra sustancialmente desplazada hacia la derecha. La naturaleza de la respuesta a cualquier temperatura dada se ve profundamente afectada por el tiempo de exposición a la misma. El crecimiento en un ambiente confinado, incluso a la temperatura óptima, cesa llegado un momento determinado a causa del gradual agotamiento de nutrientes. En atención a sus rangos de temperatura de crecimiento, pueden distinguirse cuatro grupos fisiológicos fundamentales de bacterias: termófilas, mesófilas, psicrófilas y psicrótrofas. Los microorganismos mesófilos, muchos de origen humano o animal incluyendo los patógenos y numerosos tipos de los que alteran los alimentos prefieren temperaturas moderadas; ofrecen un óptimo que generalmente se encuentra entre los 30 y 45º C y una temperatura mínima de crecimiento que suele hallarse entre 5 y 10º C. En un medio favorable, el tiempo de generación de muchos mesófilos a la temperatura óptima es de 0,5 horas, o aún menos. En los termófilos la totalidad de la gráfica que relaciona el crecimiento con la temperatura se halla desplazada hacia el rango de temperatura más alto. La temperatura para un crecimiento óptimo suele hallarse entre 55 y 65º C y en algunos casos es de hasta 75 – 90º C; la mínima se encuentra hacia los 35º C.



Todavía persiste cierta confusión con respecto al término psicrófilo. Utilizando los mismos criterios que nos han servido para definir los microorganismos mesófilos y termófilos, es lógico definir los psicrófilos en términos de su temperatura óptima de crecimiento, que debe ser claramente distinta de las de los dos citados grupos. Muchos autores, sin embargo, han clasificado como psicrófilos a todos aquellos microorganismos que son capaces de crecer a 0º C, sin tener en cuenta cual sea su temperatura óptima. Otros distinguen a los microorganismos que toleran las bajas temperaturas en psicrófilos obligados, con óptimos inferiores a 20º C y psicrófilos facultativos con temperaturas óptimas más altas. Los auténticos psicrófilos abundan en los ambientes fríos más de lo que al comienzo se pensaba, especialmente en aquellos lugares en los que se mantiene constantemente una temperatura baja. De hecho el ambiente predominante de la biosfera es frío, dado que las regiones polares y los océanos (95 % en volumen por debajo de 5ºC) representan el 14 y el 71 % de la superficie del planeta, respectivamente (Morita, 1975). Al aislar psicrófilos es preciso cuidar de un modo especial de evitar la exposición a temperaturas superiores a 10ºC. Al olvido o al desconocimiento de este hecho se deben pasados fallos en la detección de un gran número de psicrófilos. En la Tecnología de los Alimentos los microorganismos psicrófilos son menos importantes que los psicrotrofos, en virtud de su mayor sensibilidad a las temperaturas elevadas. Los auténticos psicrófilos son generalmente de origen marino siendo en este hábitat en el que mayor interés cobran y comprenden solo unos pocos géneros.




A los microorganismos capaces de crecer en las proximidades de 0º C, pero que no reúnen los requisitos de temperaturas óptima y máxima para su clasificación como psicrófilos se les conoce como psicrótrofos. Como crecen mejor a temperaturas moderadas, pueden considerarse como un subgrupo de los mesófilos capaz de desarrollarse a temperaturas inferiores a la mínima tolerada por la mayoría de los mesófilos. Entre los psicrótrofos se incluyen bacterias Gram positivas y Gram negativas; aeróbicas, anaeróbicas, y anaeróbicas facultativas; carentes y provistas de movilidad; esporuladas y no esporuladas. El grupo comprende numerosas especies pertenecientes a no menos de 27 géneros. También se encuentran cepas psicrótrofas de levaduras y mohos pertenecientes a géneros tan importantes como Penicillium y Aspergillus. Temperaturas de refrigeración son aquellas próximas, pero superiores, al punto de congelación de los alimentos, habitualmente se consideran como tales las incluidas en el rango - 1 +7ºC. El efecto de la refrigeración sobre la microflora de un determinado alimento depende de la temperatura y el tiempo de almacenamiento, así como de las características fisiológicas de los microorganismos implicados. A medida que la temperatura desciende por debajo del óptimo, el crecimiento se hace más lento y finalmente se detiene. En el rango próximo a la temperatura de crecimiento, aumenta rápidamente la fase de latencia, tanto más cuanto más baja sea la temperatura, aproximándose finalmente a infinito. En el Ciadosprium herbanm, un hongo extremadamente tolerante a las bajas temperaturas, la fase de latencia oscila entre un día a la temperatura ambiente y 18 días a -5º C.



Se han citado periodos de latencia de hasta 414 días, pero es dudoso que a lo largo de un periodo tan prolongado se haya llevado un cuidadoso control de la temperatura. En el rango de temperaturas que permite tanto el crecimiento de los mesófilos típicos como el de los psicrotrofos la fase de latencia de estos últimos es mucho más corta.  La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura; por debajo del óptimo, el crecimiento es más lento y en los rangos inferiores por debajo de 0º C) el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas. Las bajas temperaturas tienen una importante acción selectiva sobre las floras mixtas constituidas por mesófilos y psicrotrofos y pueden afectar a la composición de la carga inicial de un alimento determinado, además de conducir a modificaciones instanciales de la flora desarrollada a lo largo del tratamiento tecnológico o el almacenamiento. Así, por ejemplo, una carne vacuna refrigerada obtenida en un clima semitropical ofrece un periodo de vida útil, en condiciones de refrigeración, más largo que el de una carne similarmente tratada procedente de zonas más frías.



De acuerdo con la temperatura sobre la proporción de microorganismos tolerantes de las bajas temperaturas en la carga inicial procedente del suelo y la piel del animal; la carne de bóvido de las áreas mas frías tiene una proporción más elevada de psicrotrofos.  La temperatura de almacenamiento ejerce una poderosa influencia sobre la microflora de la leche. La leche cruda mantenida a unos 10º C desarrolla una flora en la que dominan los estreptococos acidolácticos, en tanto que si es mantenida en las proximidades de 0º C la flora dominante está constituida principalmente por bacterias Gram negativas psicrotrofas.  El enfriamiento rápido de las bacterias mesófilas, desde una temperatura normal de crecimiento hasta 0º C, causa la muerte o lesiona un cierto porcentaje de las células que componen el cultivo. Las bacterias Gram negativas, como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosas, P. fluorescens, diversas especies de Salmonella y Enterobacter aerogenes, parecen ser más susceptibles al frío que los microorganismos Gram positivos, aunque también se haya observado el shock del frío en Bacillus subtilis y Clostridium perfringens. 



Staphylococcus aureus es resistente al shock del frío se observó que un cultivo de este microorganismo en caldo tripticasa soja incubado a 5º C, manifestó un incremento en la sensibilidad al agar manitol salado evidenciando así su lesión. Los microorganismos psicrotrofos parecen ser menos sensibles al frío. El crecimiento a temperaturas inferiores a la óptima puede provocar numerosas modificaciones morfológicas y fisiológicas de los microorganismos. Entre las modificaciones morfológicas cabe citar el incrementeo del tamaño celular en la levadura Candida utilis y en Escherichia coli, la formación de filamentos en E. coli, así como el deterioro de los mesosomas y la formación de doble pared celular en B. subtilis. El descenso diferencial de las actividades de los enzimas a bajas temperaturas puede alterar las rutas metabólicas y sus productos finales. Por ejemplo, los microorganismos que sintetizan pigmentos de fenacina y carotenoides tienden a rendir tasas más altas de estos productos a bajas temperaturas, lo que tiene cierta trascendencia en la alteración de los alimentos. La producción de dextranos extracelulares por Leuconostoc y pediococos se ve favorecida por las temperaturas inferiores a las óptimas de crecimiento de estas bacterias.



La producción de lipasa y proteinasa por Pseudomonas y otros géneros ocurre preferentemente a bajas temperaturas. Algunos de estos enzimas son termorresistentes y pueden persistir después del tratamiento térmico. Muchos de los procesos reguladores del metabolismo celular son sensibles a las temperaturas inferiores a la óptima, de modo que la exposición a las bajas temperaturas puede provocar desequilibrios metabólicos y el cese del crecimiento. La incubación a bajas temperaturas puede alterar igualmente la composición lipídica de las células microbianas.  El contenido lipídico final de las bacterias es independiente de la temperatura de crecimiento, pero el de las levaduras aumenta ligeramente al descender la temperatura. Tanto las bacterias como las levaduras experimentan un incremento en la proporción de acidos grasos insaturados a medida que disminuyen las temperaturas de crecimiento; en las bacterias se producen además menos ácidos grasos que contienen el anillo del ciclopropano. También se han citado incrementos en la insaturación de los alcoholes de las ceras producidos por las cepas mesófilas de Acinetobacter crecidas a bajas temperaturas. El incremento de la proporción de ácidos grasos no saturados al descender la temperatura se cree esencial para que las membranas cumplan su función, dado que la alteración provocada desciende la temperatura a que los lípidos de la membrana "se congelan".



La proporción de ácidos grasos no saturados puede ser responsable de la capacidad de las células que soportan del frío, pero en los auxotrofos de. E coli para los ácidos grasos la distribución de estos en los lípidos de la membrana (siempre que en el medio de cultivo se hallen presentes tasas mínimas de ácidos grasos saturados y no saturados) puede variar dentro de amplios límites sin que aparentemente se vea afectada la capacidad del microorganismo para crecer a bajas temperaturas.  Los alimentos pueden alterarse bajo la acción de microorganismos pertenecientes a los cuatro grupos en que se han clasificado en virtud de su respuesta a la temperatura: psicrofilos, mesófilos y psicrotrofos. Sin embargo, si los alimentos han sido refrigerados y mantenidos a las temperaturas de refrigeración adecuadas (inferiores a 7º C) la alteración sólo será causada por los psicrotrofos. Aunque los tiempos de generación de los psicrotrofos parezcan muy prolongados, los largos periodos de almacenamiento a refrigeración utilizados en muchos alimentos permiten que la población psicrotrófica alcance tasas de muchos millones por gramo en unos pocos días, lo que frecuentemente resulta en la aparición de alteraciones desagradables en el olor, el gusto y la textura. Deben evitarse las fluctuaciones en la temperatura de almacenamiento porque la velocidad de crecimiento aumenta rápidamente con ella.



La mayor parte de los patógenos son mesófilos y, con pocas excepciones, su crecimiento no constituye un problema en los alimentos refrigerados. Las salmonelas no crecen a temperaturas inferiores a unos 6º C y en un caldo rico la fase de latencia a 10º C de la S. typhimurium es de aproximadamente 12 horas y su tiempo de generación de unas 8 horas. El crecimiento en los alimentos puede ser mucho más lento.  Así, por ejemplo, tanto la Salmonella senftenberg como la S. ententidis y la S. manhattan son incapaces de crecer a 10º C en ensalada de jamón o natillas, aunque crezcan a 7º C en pollo "a la King" Se observó que en carne de vaca picada y cruda, no crecían a 7º C inóculos de cinco serotipos de salmonella, multiplicándose, en cambio por 300 en cinco días a 12,5º C. Clostridium perfringens puede crecer a temperaturas entre 12 y 50º C, pero su desarrollo es muy lento por debajo de 15º C.  Las células vegetativas del Clostridium perfringens son sensibles a las bajas temperaturas y el almacenamiento prolongado de los alimentos a temperaturas de refrigeración es probable que resulte en su destrucción lenta si las contienen. Los esporos no se ven afectados en el mismo grado por las acciones de las bajas temperaturas.  



La velocidad de crecimiento se ve afectada además por el pH y la composición del medio, de modo que el crecimiento del C. perfingens es más lento en un medio a pH 5,8 que en otro de 7,2.  Se ha observado también la germinación de esporos de clostridios a 5º C, es decir, por debajo de la temperatura mínima de crecimiento. Staphylococcus aureus es capaz de soportar las bajas temperaturas y de crecer hasta a unos 7º C , pero el límite inferior para la producción de toxinas es algo más elevado. Se han detectado, por ejemplo, enterotoxinas en alimentos mantenidos a 10º C pero por debajo de 20º C su producción es lenta. Alcanzar niveles detectables de toxina (1 mg/ml) a 13º C exigió en una cepa 158 horas. Otras cepas crecen a 13º C pero son incapaces de producir toxina a menos de 19º C. En un medio rico, a pH 7, el tiempo necesario para la producción de toxina en cantidades mensurables osciló en la cepa estudiada por Scheusner y col. (1973) entre 78 – 98 horas a 19º C y 14 – 16 horas a 26º C.  Bajo condiciones menos favorables, la producción de toxina fue más lenta. Aunque se alcancen poblaciones abundantes de S. aureus, la producción de enterotoxina puede inhibirse mediante las acciones independientes e interactivas de la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno, la actividad de agua y el desarrolo competitivo de otros microorganismos.



Vibrio parahaemolyticus es sensible a las bajas temperaturas y las intoxicaciones alimentarias producidas en Japón por este microorganismo suelen acaecer en los meses más cálidos del año. En la superficie del pescado marino al crecimiento parece cesar a temperaturas inferiores a 5 – 8ºC, aunque el microorganismo puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo.  El Vibrio parahaemolyticus puede multiplicarse hasta alcanzar niveles peligrosos al almacenar ostras a temperaturas de 10º C durante una semana. La temperatura de crecimiento más baja publicada para el V parahaemolyticus en medios de cultivo es de 5º C,  pero el crecimiento a esta temperatura se ve fuertemente influido por el pH.  Bacillus cereus crece en el rango de temperatura de 7º a 45º C y el Bacillus subtllis entre 12 y 55º C. No se han encontrado pruebas de que el E. coli enteropatógeno crezca a temperaturas inferiores a las mínimas de los demás E. coli. El número de E. coli enteropatógenos recuperables de los quesos blandos aumenta durante el almacenamiento a 4º C, pero no está claro en las experiencias en que se hizo esta observación si tal incremento era debido a la multiplicación del microorganismo o a la recuperación después del shock térmico. Se estudió el comportamiento de seis cepas de E. coli enteropatógeno en el queso Camembert a lo largo de un proceso de maduración de 7 semanas a 10º C y observaron un marcado descenso de las tasas de cuatro de ellas; en las otras dos las tasas aumentaron ligeramente durante la primera semana y decrecieron rápidamente en las seis restantes.  Se han aislado microorganismos similares a la Yersinia enterocolitica en carne envasada a vacío y mantenida a 1 – 3º C y también se ha comprobado la producción de aflatoxina, oclaratoxina A y tremortinas A y B a 4 – 5ºC en diversos alimentos.





g. POTENCIAL DE OXIDACIÓN – REDUCCIÓN O POTENCIAL REDOX




Mientras que el pH de los alimentos se mide con facilidad y se comprende la significación de su medida, mucho más difícil resulta medir la repetibilidad del potencial de oxidación – reducción (Potencial Redox), sobre todo entre laboratorios diferentes, y además no está clara la significación que en la microbiología del producto tienen los valores hallados.  Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. Las diferencias observadas en los productos finales del metabolismo, discernibles por el consumidor por diferencias de color o sabor, pueden ser en algunos casos la consecuencia de diferencias redox.  En los alimentos picados (productos cárnicos) o en los productos no homogéneos (emulsiones), el potencial redox puede variar considerablemente de una parte a otra debido a altas concentraciones localizadas de diversos pares redox o de nutrientes como glucosa, fumarato o malato. Cuando se encuentra restringida la difusión gaseosa hacia el centro del alimento pueden existir gradientes de potencial redox desde la atmósfera hasta las partes profundas del alimento. 


El potencial redox indica las relaciones de oxígeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energía y sintetizar nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular. Los microorganismos aerobios necesitan para crecer valores redox positivos mientras que los anaerobios frecuentemente requieren valores redox negativos. En diferentes cultivos microbianos el valor redox puede oscilar dentro de un rango comprendido entre una cifra anaeróbica inferior a unos -420 milivoltios (mV) hasta una cifra aeróbica de aproximadamente +300 mV.  Los procesos de oxidación y de reducción se definen en términos de migraciones electrónicas entre compuestos químicos. La oxidación es la pérdida de electrones mientras que la reducción es la ganancia de electrones. Cuando se oxida una sustancia (libera electrones) siempre se reduce simultáneamente otra (o sea, capta los electrones liberados). Este concepto electrónico ha sugerido el desarrollo de métodos para estudiar cuantitativamente los procesos de oxidación-reducción reversibles que son vitales para las células vivas.  La medida del potencial de electrodo permite determinar el grado de reducción o de oxidación de una sustancia alimenticia determinada. Esta medida sugiere la posibilidad de clasificar los sistemas oxidantes y reductores de los alimentos en base a su intensidad.



Todo proceso redox reversible puede expresarse así:

[oxidante] + [H+] + ne = [reductor]

expresión en la que ne es el número de electrones transferidos en el proceso.

El potencial redox (Eh) de tal proceso viene dado por la ecuación concebida y desarrollada originalmente por Nernst (Pirt, 1975):


Eh = Eo + (RT/nF) ln [oxidante]/[reductor]



en la que Eo es el potencial redox estándar a pH 0 pero en presencia de otros solutos a concentración 1 M (normalmente se mide como el potencial redox del punto medio a pH 0 y se supone que su valor es igual al valor teórico de los pares redox en solución acuosa diluida), R es la constante del gas molar, T la temperatura en ºK, F la cantidad Faraday de electricidad, n el número de electrones transferidos en el proceso y ln el logaritmo natural.

En muchos alimentos es difícil obtener la verdadera medida del potencial redox. Para que el potencial redox de una muestra represente fielmente el del alimento de que fue tomada es esencial que se mantenga inalterado el ambiente gaseoso tanto si el alimento está envasado a vacío, envasado bajo una atmósfera anóxica o envasado en contacto con el aire. Puesto que el potencial redox desciende a consecuencia de la actividad metabólica, el transporte de la muestra deberá realizarse bien en condiciones de refrigeración (0 – 4º C) o a la temperatura de almacenamiento del alimento. La temperatura. y el tiempo del transporte deberán especificarse para ser consideradas en la interpretación de los resultados. El oxígeno es el principal agente que interfiere la medida del potencial redox. En general no deben usarse en la determinación del potencial redox muestras extraídas porque el oxígeno puede penetrar en la muestra durante el muestreo. Para evitar que el oxígeno contamine las muestras deberá quitarse la capa superior de la muestra de alimento bajo gas inerte para efectuar la medida.



Puesto que los valores de potencial medidos dependen del pH, cada medida de potencial redox deberá ir acompañada de la medida del pH. El pH puede cambiar el potencial redox real, pero también para el mismo valor Eh el pH puede crear condiciones favorecedoras de diferentes tipos de metabolismo. Se ha demostrado la influencia del pH sobre el potencial redox limitante del crecimiento del Clostridium perfringens. El concepto de rH se introdujo para eliminar por cálculo ésta dependencia del pH. Mientras que el rH puede calcularse exactamente cuando todos los iones hidrógeno están completamente disociados a todos los valores pH, cuando el grado de disociación es alterado por el pH se producen inexactitudes. Además, los ácidos monovalentes alteran el potencial redox 30 mV por unidad pH, los ácidos divalentes 57,7 mV y los ácidos de valencia superior hasta 120 mV. Para convertir el Eh (en voltios) en rH puede usarse la siguiente fórmula:

Eh = 0,03 (rH - 2 · pH) o rH = Eh / 0,03 + 2 · pH

El potencial redox se mide con un electrodo de metal inerte (normalmente platino) en un circuito con un electrodo de referencia. Alternativamente pueden utilizarse colorantes que cambian de color a determinados potenciales redox si bien estos indicadores pueden interactuar con los microorganismos y los alimentos obteniéndose falsos valores. El electrodo de platino responderá a cualquier sistema que produzca una reacción electroquimicamente reversible en la superficie del electrodo, siempre que la velocidad de reacción sea rápida en comparación con la captura o liberación de electrones del electrodo medidor. Con los modernos sistemas de medida de alta impedancia (1013 ohmios) pueden medirse potenciales verdaderos a partir de pares redox que producen corrientes de cambio muy bajo. En los sistemas que reaccionan con relativa rapidez tales como el Fe2+/Fe3+ pueden obtenerse medidas cuando la concentración del par es tan baja como 10-5 M. La calibración de electrodos redox está relacionada teóricamente al electrodo de hidrógeno estandar, aunque en la práctica se usa un electrodo de calomelano u otro tipo de electrodo de referencia. Para la medida potenciométrica del potencial redox de muestras de alimentos líquidos se usan los electrodos de platino estandar y de calomelano. Para medidas sobre alimentos sólidos se necesita utilizar electrodos especiales con punta de platino afilada, que tengan escaso diámetro y gruesa pared y puentes de CIK-agar en tubos con punta rellena de fibras de asbestos fundido. A diferencia de los electrodos de pH, los electrodos redox requieren cierto tiempo (dependiente del tipo de muestra) para revelar el potencial redox.


El potencial redox de los alimentos depende de las cantidades relativas de sustancias oxidadas y reducidas que contengan. Los alimentos que tienen grandes cantidades de tales sustancias son resistentes a los cambios del potencial redox y se llaman "fuertemente tamponados". De aquí que no sea fácil la interpretación de la lectura arrojada por un electrodo redox insertado en un alimento, puesto que el alimento puede estar o no fuertemente tamponado. En los alimentos débilmente tamponados una pequeña población microbiana (< 105/g) posiblemente puede causar un cambio del potencial redox, mientras que en los alimentos fuertemente tamponados una población microbiana grande (> 108/g) apenas puede afectar al potencial redox. Para poder juzgar la significación de cualquier cambio del potencial redox de un alimento hay que tener en cuenta el potencial metabólico y el tamaño de la población microbiana en relación con la capacidad tampón redox del alimento.  Las medidas redox tienen la máxima utilidad cuando existen pares reversibles de componentes conocidos que se encuentran en equilibrio. Todo alimento puede contener pares redox pero algunos no se encuentran en equilibrio y otros son irreversibles. Se ha sugerido que la sonda redox puede ser un monitor adecuado de alteraciones o cambios deseables durante el almacenamiento de alimentos envasados a vacío, bajo atmósferas de gas anóxico o enlatados. Se ha visto que indica con exactitud tales cambios profundos en la carne en postrigor, donde se encuentran relaciones empíricas reproducibles entre los eventos metabólicos y el potencial redox.



En tales circunstancias los principales sustratos o productos microbianos muestran alta actividad con el electrodo y pueden enmascarar todas las reacciones colaterales o interferentes de forma tal que el potencial redox medido es la verdadera representación del estado del par redox dominante.
En presencia de oxígeno todos los pares redox de los alimentos tienden hacia el estado totalmente oxidado. Aunque el oxígeno disuelto no influye en la sonda de platino en presencia de agua pura, en presencia de soluciones salinas (incluyendo alimentos tales como el jamón y las verduras encurtidas) se producen reacciones electrolíticas que pueden sensibilizar la sonda al oxígeno disuelto haciendo que indique valores redox artificialmente altos positivos). En tales circunstancias el potencial redox aparente será función del logaritmo de la concentración del oxígeno disuelto y por tanto grandes cambios del potencial redox representarán pequeños cambios de la tensión del oxígeno disuelto. Jacob (1970) señaló una caída de 60 mV por el 90 % de reducción de la concentración del oxígeno disuelto. A tensiones de oxígeno disuelto muy bajas las sondas redox pueden exhibir relaciones empíricas entre el oxígeno y los cambios metabólicos. Sin embargo, a estos bajos niveles de oxígeno la bioquímica de los microorganismos y los alimentos bioquímicamente activos sufren cambios metabólicos que alteran de forma impredecible estas relaciones.



El potencial redox y el pH se pueden controlar en los medios de cultivo, y probablemente en los alimentos, ajustando la concentración de O2 gaseoso y CO2 del espacio de cabeza existente sobre el medio.  Aunque en teoría puede alcanzarse un equilibrio estable entre las concentraciones en las fases de gas y de agua (relativas a la solubilidad de los gases en el medio de cultivo y la temperatura), la captación de O2 y la liberación de CO2 por los cultivos microbianos excederá con frecuencia de tales concentraciones. El potencial redox puede reducirse rápidamente durante la germinación y crecimiento de los esporos puesto que, aunque inicialmente sólo germina una pequeña proporción de los esporos, los esporos que germinan y crecen producen nicotinamida adenín dinucleótido reducido (NADH) y otros reductores que reducen la concentración de oxígeno a un nivel no inhibidor para los esporos remanentes. Esta reducción del nivel de oxígeno y la mayor tensión de H2 producida por el metabolismo celular se traduce en una gran caída del potencial redox. Los ambientes creados en los alimentos pueden categorizarse a groso modo como aquellos en los que el acceso de oxígeno está restringido y en los que no está restringido.



En los que el acceso de oxígeno es limitado los microbios que se desarrollan producen CO2 + H2O como principales productos finales; aunque la producción de productos finales tales como ácidos orgánicos no es significativa, entre los metabolitos secundarlos pueden incluirse aminas, etc. Cuando el acceso al oxígeno es restringido ocurre la fermentación y pueden impartirse cambios de aroma al alimento antes de que se altere. Antes de que tales cambios sean detectables por el consumidor tiene que alcanzarse un alto número de microorganismos (> 106 /gm). Algunos microorganismos, como los aerobios estrictos y los anaerobios, sólo poseen un sistema metabólico terminal para obtener energía y en consecuencia solamente son activos dentro de un margen de potencial redox relativamente estrecho. Otros, como los anaerobios facultativos, tienen sistemas alternativos que pueden ser puestos en marcha o paro por el potencial redox o la presencia o ausencia de oxígeno.







"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HABITO"

ARISTOTELES






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