lunes, 18 de abril de 2016

NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO de AGUAS y ALIMENTOS (VI Parte)

“El médico del futuro no tratará el cuerpo humano con medicamentos, más bien curará y prevendrá las  enfermedades con la nutrición" 
(Thomas Alva Edison)



NUEVA GUÍA PRÁCTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO 
de AGUA y ALIMENTOS (VI Parte)






ETA: Clasificación y características de los principales patógenos microbianos

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos se conocen desde épocas muy remotas. En el 2000 A.C, Moisés había dictado leyes sobre los alimentos que se podían comer y los que se debían rechazar, así como también estaban legislados los métodos de preparación y la importancia de la limpieza de las manos antes de ingerir los alimentos. Generalmente los relatos de intoxicaciones alimentarias que registra la historia antigua se atribuían a productos químicos venenosos, a veces incorporados deliberadamente. Recién en el siglo XIX se tuvo conocimiento de las enfermedades alimentarias producidas por gérmenes.  Antiguamente se relacionaban los alimentos contaminados con el estado de putrefacción de los mismos. Hoy se sabe que los alimentos contaminados con microorganismos pueden tener aspecto, olor y sabor normal. Antony van Leeuwenhoek, un científico holandés que en 1674 observó, en una gota de agua de un lago, a través de varios lentes que formaban un primitivo microscopio, la presencia de pequeños organismos en forma de bastones.  En una carta del 7 de setiembre de ese año, describió lo que había visto a través de su novedoso artefacto: “Extraje agua de un lago y, examinándola detenidamente, encontré flotando ahí dentro unas partículas terrosas y algunas rayas verdosas enrolladas en forma de espiral y ordenadamente acomodadas. La circunferencia entera de cada una de estas rayas estaba sobre el grueso de un pelo de una de sus cabezas, todas consistentes de glóbulos verdes muy pequeños que permanecían juntos”.



Sus dibujos reflejaron que se trataba de las primeras bacterias descriptas; sin embargo sus descubrimientos no fueron tomados en cuenta en aquella época. Sólo doscientos años después, cuando Luis Pasteur demostró el papel que jugaban las bacterias en las fermentaciones de vinos y de cervezas, se apreciaron estos hallazgos. Pasteur investigó enfermedades en animales y hombres demostrando que las mismas eran causadas por bacterias. También observó que si los alimentos eran esterilizados a través de una rigurosa cocción, se producía la muerte de la bacteria y el alimento sólo podía recontaminarse por razones externas (utensilios, manipulaciones, etc.).  Al descubrirse el modo de difusión de estas enfermedades se empezaron a aplicar métodos de prevención y tratamiento. En el año 1854 John Snow descubrió que el agua contaminada podía favorecer la difusión del cólera. Años más tarde se descubrió en Suiza que la fiebre tifoidea también era vehiculizada por el agua.  A fines del siglo XIX se vio que la leche participaba en la difusión de importantes enfermedades, introduciéndose la pasteurización (tratamiento que destruye las bacterias nocivas). En el año 1888 fue aislada por primera vez una bacteria causante de un brote de intoxicación alimentaria por consumo de carne cocida. A principios del siglo XX fueron descubiertas otras bacterias (Salmonellas, Staphylococcus, etc). Una defectuosa preparación, cocción o almacenamiento de un alimento, son las principales causas para la aparición de las bacterias en cualquier plato de comida, que comienzan a multiplicarse y hacen que el consumo del alimento sea peligroso para la salud. La presencia de bacterias no siempre se hace visible en los alimentos, no siempre presentan cambios de sabor, olor o, incluso, alteraciones en su aspecto. El objetivo de la higiene en este sentido es garantizar la producción y elaboración de alimentos que sean inocuos y limpios.



Si se revisan las causas de cómo se produjo una ETA, pueden encontrarse los siguientes factores:

1. Enfriamiento inadecuado.
2. Preparación con demasiada anticipación al consumo.
3. Almacenamiento inadecuado.
4. Conservación a temperatura ambiente.
5. Cocción insuficiente. (temperaturas inadecuadas de cocción)
6. Conservación caliente a temperatura inadecuada.
7. Higiene personal insuficiente.
8. Contaminación cruzada.
9. Ingredientes de origen dudoso.
10. Contacto de alimentos con animales y/o sus excrementos.


La Organización Mundial de la Salud (OMS), ha definido a la ETA como “Enfermedad de carácter infeccioso o tóxico que es causada, o que se cree que es causada, por el consumo de alimentos o de agua contaminada”.



El Comité de Expertos de la OMS analizó que la mayoría de las enfermedades por alimentos son de origen microbiano, que tal vez sea el problema más extendido en el mundo contemporáneo y una causa importante de la reducida productividad económica. Según los investigadores de la OMS, las ETA constituyen una patología con una proporción de personas en condiciones de contraer la enfermedad que alcanza a todos los estratos poblacionales, es decir que todos somos susceptibles a las enfermedades causadas por alimentos contaminados.   La Organización estima que cada año mueren 1 millón de niños menores de 5 años en países en vías de desarrollo, lo que implica 2.700 decesos por día. Según el Comité de Expertos, en América Latina durante el año 2013 se reportaron más de 500 brotes de ETA, los cuales ocurrieron en un 40 % en el ámbito doméstico y sólo un 9 % en puestos callejeros y restaurantes.


Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos pueden generarse a partir de un alimento o de agua contaminada. Son llamadas así porque el alimento actúa como vehículo de transmisión de organismos dañinos y sustancias tóxicas.  Un brote de ETA se da cuando dos o más personas sufren una enfermedad similar después de ingerir un mismo alimento y los análisis epidemiológicos señalan al alimento como el origen de la enfermedad, que luego es confirmado por el laboratorio. 

Las ETA(s) pueden manifestarse a través de:

a. Infecciones transmitidas por alimentos: son enfermedades que resultan de la ingestión de alimentos que contienen microorganismos perjudiciales vivos. Por ejemplo: salmonelosis, hepatitis viral tipo A y toxoplasmosis.
b. Intoxicaciones causadas por alimentos: ocurren cuando las toxinas o venenos de bacterias o mohos están presentes en el alimento ingerido. Estas toxinas generalmente no poseen olor o sabor y son capaces de causar enfermedades después que el microorganismo es eliminado. Algunas toxinas pueden estar presentes de manera natural en el alimento, como en el caso de ciertos hongos y animales como el pez globo. Ejemplos: botulismo, intoxicación estafilocócica o por toxinas producidas por hongos.
c. Toxiinfección causada por alimentos: es una enfermedad que resulta de la ingestión de alimentos con una cierta cantidad de microorganismos causantes de enfermedades, los cuales son capaces de producir o liberar toxinas una vez que son ingeridos. Ejemplos: cólera, estafilococosis.



Los síntomas varían de acuerdo al tipo de contaminación, así como también según la cantidad del alimento contaminado consumido. Los síntomas más comunes son vómitos y diarreas, también pueden presentarse dolores abdominales, dolor de cabeza, fiebre, síntomas neurológicos, visión doble, ojos hinchados, dificultades renales, etc.  Según la Food and Drug Administration (FDA) del Gobierno de EE. UU. el 2% o 3% de ETA pueden llevar a una enfermedad de largo plazo. Por ejemplo, Escherichia coli O157: H7 puede provocar fallas en el riñón en niños e infantes, las Salmonelas pueden provocar artritis reactiva y serias infecciones y Listeria monocytogens puede generar meningitis o aborto. Sin embargo, existen malestares provocados por los alimentos que no se consideran ETA, como las alergias, las que no se pueden asociar con los alimentos que la provocan y que son los que han sufrido un proceso de fermentación (vinos, cerveza, quesos, yogur). 


Para las personas sanas, la mayoría de las ETA son enfermedades pasajeras, que sólo duran un par de días y sin ningún tipo de complicación. Pero algunas ETA más graves pueden llegar a ser muy severas, dejar secuelas o incluso hasta provocar la muerte en personas susceptibles como son los niños, los ancianos, mujeres embarazadas y las personas enfermas. Los alimentos presentan siempre microorganismos en su superficie o en su interior. Estos microorganismos pueden ser, atendiendo a su origen, endógenos (ya presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmisibles al hombre y enfermedades vegetales no transmisibles al hombre) o exógenos (se incorporan al alimento durante su manipulación y procesado); y, atendiendo a su relación con el consumidor, pueden ser agentes patógenos o alterantes (saprófitos). Los agentes endógenos o son inocuos (patógenos de plantas) o son eliminados en mataderos (animales enfermos) o durante el procesado (pasteurización).



En cualquier caso, los alimentos son una vía importante de transmisión de microorganismos que pueden causar infecciones e intoxicaciones que, en general tienen un tiempo de incubación corto (2–10 hs) y suelen cursar con síndromes gastrointestinales. Puesto que algunas de estas patologías tienen una DMI (dosis mínima infectiva) muy baja es muy necesaria la higiene de los alimentos y de los procesos de elaboración.  La incidencia real de las toxiinfecciones no está clara por que solo se declara un 10 % de estas enfermedades entre las que se encuentran salmonelosis, shigelosis o disentería bacilar, gastroenteritis por Escherichia coli enteropatógeno, enteritis causada por Yersinia enterocolitica, diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otros vibrios próximos al V. cholerae, enteritis causadas por Campylobacter, enteritis producidas por Bacillaceae, intoxicaciones alimentarias agudas como el botulismo (intoxicación por Clostridium botulinum) y la intoxicación estafilocócica, intoxicaciones alimentarias crónicas causadas por hongos, virosis transmitidas por alimentos como la hepatitis de tipo A, enfermedades causadas por protozoos y transmitidas por alimentos y enfermedades causadas por helmintos. Aisladamente cada una de las patologías anteriores puede prevenirse mediante un tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado cuando se trata de producción de alimentos o comidas a gran escala puesto que en estas condiciones es más factible una contaminación que produce un elevado número de víctimas.






PLANES de MUESTREOS y CRITERIOS MICROBIOLOGICOS

En la elaboración de un alimento se pueden identificar una serie de pasos en los que puede producirse la contaminación del alimento por microorganismos o en los que los microorganismos ya presentes en el alimento pueden multiplicarse con mayor facilidad. Estos pasos del proceso se denominan “puntos críticos” y sobre ellos hay que actuar a la hora de mejorar las características microbiológicas del alimento en cuestión.  Un producto tiene buena calidad microbiológica cuando sus cargas microbianas son reducidas y constantes (esto es, no presentan variaciones estacionales o de cualquier otro tipo de periodicidad que impiden que el producto sea homogéneo a lo largo del tiempo). Para lograr un aumento de la calidad microbiológica de un alimento lo que hay que hacer es determinar en la Industria cuáles son los puntos críticos del proceso y evitarlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribución del alimento (BPE).



La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiológica y no en comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relación costo – beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el desarrollo de las BPE hay que hacer un análisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnológicos. Este riesgo depende de la DMI (Dosis Mínima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asimismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el número de raciones o partes consumidas por la población en un determinado tiempo.

La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la fórmula:

l = log10(N0/Nc)

donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiológica del producto disminuyen y el análisis microbiológico es más consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.




El análisis microbiológico de los alimentos no tiene carácter preventivo sino que simplemente es una inspección que permite valorar la carga microbiana. La prevención se logra como se indicó anteriormente. Puesto que el control microbiológico es un proceso analítico es necesario seguir una serie de criterios sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales. 

En este sentido, es necesario considerar:

1) la distribución desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos;
2) que el número de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe limitarse al mínimo necesario para así poder aumentar el número de análisis y
3) que los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento.

Un protocolo de análisis de alimentos correcto debe considerar:

1) la heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos,
2) el proceso de transporte de las muestras del sitio de recolección al laboratorio evitando la multiplicación de los microorganismos presentes o la inactivación de algún microorganismo;
3) que es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora ésta inocua, utilizando medios selectivos;
4) los tratamientos tecnológicos pueden producir daños subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selectivos y es necesaria la utilización de medios de recuperación y
5) que, en cualquier caso, es necesario realizar una evaluación sistemática de los medios de cultivo para prevenir la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo.


El planteamiento del muestreo del alimento es diferente si se trata de un muestreo único (caso de una partida que llega por primera o única vez al centro de control microbiológico) del muestreo repetido. Cuando hay que hacer un muestreo de una partida única de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboración y conservación del alimento. Ningún muestreo único puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento y, como norma general, es conveniente analizar un número de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. En el caso de un muestreo repetido, un sistema basado en el análisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligará al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.  En la rutina de trabajo del laboratorio no siempre es práctico; pensemos en lo engorroso que sería tomar el 10 % de un universo de 1000 latas de conserva, por ejemplo (100 latas). Nuestra experiencia personal, nos lleva a inferir que puede ser monitoreado con valores de muestras que no sobrepasen los 300 grs de cada efecto ser analizado (efectos a granel); en el caso de las conservas, se investigará una lata del lote recibido y tomada al azar, con un peso mínimo de 250 grs o su equivalente, teniendo la precaución de tomar aquellas latas que pudieran tener un índice macroscópico de sospecha, como ser: abolladuras, abultamientos, etc.  



La muestra a analizar debe de ser tomada respetando las normas básicas de higiene y de esterilidad; para ello utilizaremos dos frascos de vidrio estériles con tapa metálica a rosca del tipo mermelada. De ser posible, tomar la muestra en el laboratorio y al lado de un mechero de Bunsen, utilizando plato y cubiertos de aluminio flameados con alcohol. De no ser posible éste procedimiento, se tomará la muestra in situ y flamearemos los utensilios antes mencionados con un hisopo embebido en alcohol.  Ahora bien, al llegar al lugar de trabajo, la muestra obtenida (muestra madre), debe fraccionarse en dos partes (muestras de trabajo): en un frasco estéril pesaremos higiénicamente 10 grs de dicha muestra a los que añadiremos 90 ml de solución buffer de fosfato de sodio 9 N, diluida 1 ml de la misma, en 100 ml de agua destilada estéril. De no contar con éste tampón, se aconseja el uso de agua destilada estéril o de solución fisiológica estéril y no otras soluciones o diluyentes. Obtenemos así una dilución de la muestra madre de 1:10 y de allí partimos para investigar todos los microorganismos indicadores y patógenos, consignados en el Código Alimentario Argentino. Para la investigación del género Salmonella, debemos partir de una muestra de trabajo de 25 grs de la muestra madre, diluida en 225 de buffer fosfato o agua destilada estéril. NUNCA debemos desechar la muestra madre, la que se mantendrá convenientemente refrigerada hasta terminar con las marchas investigativas.
Analizaremos ahora cómo y porqué se aplica el término de “criterio microbiológico” y daremos ejemplos de la realización de un plan de muestreo.



Un criterio microbiológico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos basándose en la ausencia o presencia o el número de microorganismos y/o la investigación de sus toxinas por unidad de masa, volumen o área. Un criterio microbiológico, según se detalla en "Principios para el Diseño y la Aplicación de Criterios Microbiológicos Para Alimentos" - Codex Alimentarius Commission, consiste en:

      Señalar el alimento al que se aplicará el criterio,
      Elección de microorganismos y/o sus toxinas/ metabolitos a identificar y la razón de la elección para el producto,
      Un plan de muestreo indicando el número de muestras a tomar, el tamaño de la misma y las características de la unidad analítica,
      Los métodos para su detección y/o cuantificación,
      Los límites microbiológicos considerados apropiados para el alimento en el punto indicado de la cadena alimentaria,
      El número de unidades analíticas donde se debe verificar el cumplimiento de dichos límites.

Al establecer un criterio microbiológico se tienen que tener en cuenta los siguientes factores:

      Evidencia epidemiológica de que el alimento en cuestión es un vehículo significativo de enfermedad.
      Susceptibilidad del alimento a ser contaminado por patógenos.
      Probabilidad de crecimiento microbiano en el alimento durante su manufactura, almacenamiento, distribución y preparación.
      Tratamiento que recibe el alimento antes de ser consumido (proceso de cocción, etc.).
      La susceptibilidad de los probables consumidores a agentes patógenos y toxinas.

Para establecer un criterio microbiológico se debe definir previamente cuál será el propósito del mismo, éste puede comprender la evaluación de:

      La inocuidad del alimento: para este propósito se requiere la determinación de microorganismos patógenos y/o toxinas y en algunos casos la utilización de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un patógeno).
      El cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM).
      La utilidad de un alimento como ingrediente para un propósito determinado.
      La vida útil de un alimento a fin de determinar su fecha de vencimiento.
           

La evaluación que se hace de la inocuidad de los alimentos y de su aptitud para el consumo humano a través del cumplimiento con el criterio microbiológico designado para el producto en cuestión, puede referir a ausencia de patógenos o a la demostración de la aplicación de Buenas Prácticas de Higiene. La comparación entre los resultados de laboratorio obtenidos y los criterios microbiológicos establecidos puede brindar información importante tanto para el productor/ elaborador como para los servicios de inspección en lo referente a la aceptabilidad del producto y / ó proceso. No basta con los criterios microbiológicos para lograr este objetivo, sino que es de suma importancia verificar la aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura u otros sistemas (por ejemplo, HACCP) para asegurar que los microorganismos indeseables sean eliminados o minimizados a un nivel tal que no puedan ocasionar daño a los seres humanos. En Argentina, el Código Alimentario Argentino establece dos categorías principales en cuanto a los criterios a seguir para la elaboración de patrones microbiológicos (provenientes de la Resolución M. S. y A. S. N° 003 del 11.01.95- de "Principios Generales Para El Establecimiento De Criterios Y Patrones Microbiológicos Para Alimentos MERCOSUR" - GMC - RES Nº 059/93):

  •     Criterio obligatorio: se utiliza para referirse a los microorganismos considerados patógenos y/o sus marcadores, considerados de importancia en salud pública y de acuerdo con la clase de alimento. En este caso su hallazgo constituye razón suficiente para imputar la infracción y proceder en consecuencia, en forma preventiva o represiva, imponiendo las sanciones que correspondan.

  •     Criterio complementario (recomendatorio): a diferencia del anterior es el criterio relativo a la evaluación del proceso tecnológico utilizado para la obtención de un producto. Puede orientar al fabricante, aconsejar acerca de puntos sin control, y su seguimiento permitirá inferir o determinar la "falla", que se demuestra en los protocolos analíticos. No tiene por finalidad la inspección final, con lo que se indica que de su incumplimiento no derivarán sanciones.
·  

   En ese momento se destacará la idoneidad del inspector actuante, quien sugerirá las acciones correctivas y se pondrá a prueba la responsabilidad del elaborador, a quien de de manifestarse remiso a adecuarse, sí se le aplicará la sanción correspondiente. Cuando se evalúa el riesgo microbiológico asociado a un alimento específico todos los microorganismos transmisibles a través de los alimentos deben ser considerados incluyendo bacterias, virus, hongos, levaduras, algas y parásitos. Los riesgos asociados como las toxinas/ metabolitos producidos por estos organismos y algunas propiedades intrínsecas (por ejemplo la resistencia a antibióticos) deben también ser considerados en la evaluación. La presencia de algunos microorganismos en los alimentos no es necesariamente un índice de riesgo para el consumidor. Vegetales y animales son la principal fuente de los alimentos que comemos y se encuentran naturalmente asociados a microorganismos, lo que implica que los alimentos que de ellos se obtengan también estarán asociados naturalmente a microorganismos. 




     Los microorganismos elegidos para la elaboración del criterio deben ser relevantes para el alimento y circunstancias particulares (producto crudo o listo para consumir, perfil del consumidor del producto). Si el criterio establece la búsqueda de microorganismos indicadores, su propósito debe ser detallado claramente (por ejemplo, detectar higiene inadecuada, indicar posible presencia de patógenos). Es importante tener presente que, mientras para un alimento cocido o listo para consumir la tolerancia para un determinado microorganismo es cero, sí se puede permitir la presencia del mismo en el alimento crudo – dentro de ciertos niveles- si éste fuera sometido a un tratamiento previo a su consumo por el cual se eliminará dicho microorganismo (por ejemplo, cocción). En este mismo sentido, la interpretación del resultado es diferente según se trate de producto crudo o producto cocido o listo para consumir.








"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HÁBITO"

ARISTOTELES








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lunes, 4 de abril de 2016

NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO de AGUAS y ALIMENTOS (V Parte)

“El médico del futuro no tratará el cuerpo humano con medicamentos, más bien curará y prevendrá las  enfermedades con la nutrición" 
(Thomas Alva Edison)



NUEVA GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO 
de AGUA y ALIMENTOS (V Parte)





j. ÁCIDOS ORGÁNICOS


Los ácidos orgánicos y sus ésteres se hallan muy difundidos en la naturaleza. Se encuentran con frecuencia en frutas; por ejemplo, el ácido cítrico de los frutos cítricos, el ácido benzoico en arándanos agrios y las ciruelas verdes, el ácido sorbico en la fruta del fresno. El ácido láctico se encuentra en los tejidos animales; el galato de metilo en las hojas de diversos géneros de plantas y en las especias se encuentran varios ácidos orgánicos. Muchos de ellos constituyen metabolitos intermediarios y productos finales del metabolismo microbiano y se encuentran en grandes cantidades en muchos productos lácticos, cárnicos y vegetales fermentados. Nuestros antepasados descubrieron que los cambios deseables desarrollados sobre el aroma y la textura de estos productos y la acidez provocada por la formación de ácidos orgánicos constituía un medio valioso para retrasar o evitar la alteración proteolítica. Ello permitió conservar almacenados muchos alimentos perecederos y hacer la dieta más variada. Hoy en día muchos fabricantes utilizan ciertos ácidos orgánicos para ayudar a la conservación de diversos productos. Sin embargo, la concentración y el tipo de ácidos orgánicos permitida son cuidadosamente controlados por los organismos gubernamentales responsables de la Sanidad, y las concentraciones permitidas son generalmente pequeñas, comparadas con las de los ácidos orgánicos en muchas frutas y productos fermentados.



Por su solubilidad, sabor y baja toxicidad los ácidos orgánicos de cadena corta, tales como el acético, benzoico, cítrico, propiónico, y sórbico son muy utilizados como conservadores o acidificantes. Al considerar la posible utilización como conservadores de otros ácidos orgánicos es conveniente recordar que la actividad antimicrobiana de estos compuestos suele ser superior a medida que se alarga la longitud de su cadena molecular. Sin embargo, los ácidos alifáticos de más de diez u once átomos de carbono poseen muy poca aplicación potencial debido a su muy baja solubilidad en agua. Los métodos de análisis de los ácidos orgánicos en los alimentos se basan generalmente en una destilación en corriente de vapor, o por solventes, seguido de una valoración del tipo y proporción del ácido (o ácidos) en cuestión presentes en el destilado mediante espectrofotometría o cromatografía. Los detalles de los métodos pueden hallarse en la mayor parte de los libros de texto o tratados de análisis químico, como por ejemplo los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC. La actividad antimicrobiana de un ácido orgánico o su éster se debe a las moléculas no disociadas de este compuesto. Algunos ácidos orgánicos en su estado no disociado son muy solubles en las membranas celulares. Únicamente los ácidos orgánicos lipófilos muestran actividad antimicrobiana. Según una hipótesis, estos compuestos inhiben el crecimiento de los microorganismos, o los matan, por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento en el transporte de sustratos y en la fosforilización oxidativa del sistema transportador de electrones. Los ácidos orgánicos saturados, como el ácido sórbico y los ésteres del ácido parahidroxihenzoico, también inhiben el sistema de transporte de electrones.



Este fenómeno da lugar a la acidificación del contenido celular, que es probablemente la principal causa de la inhibición y muerte de los microorganismos. El pKa (pKa = al pH en el cual el 50 % del ácido se halla no disociado) de los ácidos orgánicos empleados como conservadores se halla en el rango de pH de 3,5. Al bajar el pH de un alimento, aumenta la proporción de las moléculas no disociadas de un determinado ácido orgánico, aumentando de esta forma su efectividad como agente antimicrobiano. Estas consideraciones limitan la utilidad de los ácidos orgánicos a aquellos alimentos de pH inferior a 5.5. Los ácidos orgánicos se utilizan principalmente como agentes micostáticos.  Sin embargo, a concentraciones elevadas, resultan muy eficaces frente a diversos microorganismos (incluidos los virus): por ejemplo, cuando sus concentraciones son superiores al 1% en frutas y productos fermentados con microorganismos, o cuando se acidifica hasta pHs de 4,0 o valores inferiores. Los efectos observados en cultivos mixtos o en alimentos almacenados en los que un microorganismo ejerce un efecto sinérgico o antagónico sobre otro, se cree que, en muchos casos, se debe a la formación "in situ" de ácidos orgánicos como productos secundarios del crecimiento microbiano.  La mayor parte de los ácidos orgánicos son muy poco eficaces como inhibidores del crecimiento microbiano a pHs de 5,5-5,8 en los que crecen la totalidad de las bacterias causantes de toxinfecciones y la mayor parte de las causantes de alteración. Constituyen una excepción los ésteres del ácido paraludroxibenzoico, con un pKa = 8,5, que muestran actividad antimicrobiana a pHs próximos a la neutralidad, y los ácidos propiónico y sórbico que también poseen cierta actividad a pH = 6,0 ó 6,5.



Existen muchas publicaciones en la literatura científica y muchas patentes que atribuyen un espectro amplio de actividad antimicrobiana a una gran variedad de ácidos orgánicos de cadena recta ramificada, saturados o insaturados. Un cierto número de ácidos orgánicos saturados de cadena más larga son muy eficaces como inhibidores, tanto de las bacterias Gram positivas como Gram negativas, pero la actividad frente a las gram-negativas cae rápidamente en aquellos con más de ocho átomos de carbono. La refrigeración aumenta la actividad bactericida de los ácidos nonanoicos y decanoicos frente a Escherichia coli. Los ácidos grasos no saturados de cadena larga son particularmente eficaces contra las células vegetativas de las bacterias Gram-positivas y evitan también la germinación de los esporos de las especies de Bacillus. Los cis-isomeros son más eficaces que los trans-isomeros y la actividad de un compuesto con determinado tamaño molecular aumenta con el grado de insaturación de la molécula. Por lo general, la utilización de ácidos orgánicos es compatible con la de otros conservadores o sistemas de conservación y de hecho muchas combinaciones poseen un efecto sinérgico. Por ejemplo, muestran mayor eficacia como inhibidores microbianos a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento y mayor como microbicidas a medida que la temperatura aumenta.  Algunos ejemplos de combinaciones sinérgicas son las siguientes: a) benzoato con anhidrido sulfuroso, anhidrido carbónico, cloruro sódico o sacarosa; b) propionato con anhidrido carbónico; c) sorbato con sacarosa, cloruro sódico o con nisina y polifosfato; d) ácido láctico con ácido acético; e) propionato con sorbato (contra los estafilococos); y f) ácido benzoico y bórico contra los aspergillus.



Cuando se utilizan tales combinaciones se precisan concentraciones inferiores de cada uno de los componentes para obtener el mismo efecto protector. La eficacia de los ácidos orgánicos como agentes antimicrobianos se mejora, generalmente, por los aniones que interfieren con la disociación de la molécula de ácido. Determinados cationes pueden también aumentar de una manera significativa la eficacia de los ácidos orgánicos aumentando la solubilidad del ácido en la membrana de la célula microbiana. Algunos microorganismos parecen poseer un sistema de transporte de ácidos orgánicos desde la célula, que es inducible y funciona mediante un aporte energético, lo que permite su crecimiento en presencia de elevadas concentraciones de ácidos. La formación de peróxidos y otros productos resultantes de la oxidación de los ácidos grasos puede aumentar la eficacia antimicrobiana de ciertos ácidos grasos insaturados. Sin embargo, los ácidos orgánicos, al igual que la mayor parte de inhibidores microbianos, suelen ser más eficaces en condiciones anaeróbicas, que aeróbicas. Existen varias limitaciones al valor como inhibidores microbianos de los ácidos orgánicos en los alimentos:

1. Suelen resultar ineficaces cuando los niveles iniciales de microorganismos son elevados.
2. Muchos microorganismos utilizan los ácidos orgánicos como fuente metabolizable de productos carbonados.
3. Existe una variabilidad inherente en cuanto a la resistencia de determinadas cepas.
4. En determinadas condiciones de utilización, pueden resultar seleccionados tipos de microorganismos resistentes.


El ácido acético y sus sales son muy eficaces como acidificantes y conservadores y son muy utilizados para estos propósitos. Únicamente los Ácetobacter sp., algunas bacterias lácticas y algunos mohos y levaduras muestran cierto grado de resistencia a este compuesto. La presencia de 1-2 % de ácido acético no disociado en carne, pescado, o vegetales suele inhibir o matar todos los microorganismos presentes, aunque, en condiciones normales de utilización, especialmente en malas condiciones higiénicas, pueden sobrevivir los microorganismos más acidotolerantes. Esta concentración de ácido puede reducirse significativamente si se trata de productos refrigerados o con una elevada concentración de sal o azúcar. El crecimiento de la mayor parte de las bacterias causantes de toxiinfecciones y de las esporulantes, se inhibe con concentraciones de 0,1 %, y el de los mohos micotoxigénicosa concentraciones de 0,3 %. El ácido benzoico se usa esencialmente como agente micostático. Muchas levaduras y mohos se inhiben a concentraciones de 0,05 – 0,1% de ácido no disociado. Las bacterias esporulantes y causantes de toxiinfecciones se inhiben generalmente con concentraciones de 0,01-0,02 % pero la mayor parte de las bacterias causantes de alteraciones son mucho más resistentes y no debe, por tanto, confiarse en el ácido benzoico para la conservación de los alimentos capaces de permitir el crecimiento bacteriano. Los ácidos cítrico y láctico, tienen por lo general, solamente una actividad antimicrobiana moderada y excepto a bajos valores de pH, no resultan eficaces como inhibidores. Sin embargo, una concentración de ácido cítrico no disociado de 0,001 % inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus en condiciones anaeróbicas. Tanto el ácido cítrico como el láctico parecen inhibir específicamente la formación de aflatoxinas y sterigmatocystina.




k.  ANTIBIÓTICOS Y ALIMENTOS
Los antibióticos, producidos por microorganismos o sintéticamente, inhiben a los microorganismos a grandes diluciones. Los microorganismos de los alimentos pueden convertirse en antibiótico resistentes y colonizar el intestino del hombre y de los animales; sus residuos pueden asimismo ejercer una acción selectiva favoreciendo a la flora resistente ya existente en el intestino; en estas condiciones los antibióticos empleados terapéuticamente pueden resultar ineficaces. Una de las más importantes razones de la persistencia de bacterias resistentes es el empleo indiscriminado de medicamentos antimicrobianos en el hombre y en el ganado (WHO, 1976). Los microorganismos antibiótico resistentes carecen de interés en los alimentos procesados térmicamente, debido a que, en general, hay que esperar que se destruyan durante el tratamiento; sin embargo, pueden encontrarse en los alimentos crudos y llevar a cabo la contaminación de otros alimentos.  Como consecuencia del gran éxito terapéutico de los antibióticos en las enfermedades bacterianas, era natural que se ensayasen como conservadores frente al deterioro microbiano de los alimentos. Estos ensayos se realizaron entre 1945 y 1960 y la mayoría de los antibióticos se comprobaron en múltiples alimentos perecederos de todas las formas imaginables.  A medida que fue aumentando el miedo a los microorganismos antibióticoresistentes fue disminuyendo el empleo de los antibióticos como conservadores de los alimentos.  Los dos antibióticos más importantes empleados en muchos países con fines conservadores alimenticios son la natamicina y la nisina, ninguno de los cuales se utiliza en terapéutica. La tilosina (un antibiótico macrólido), entre los antibióticos poco resistentes se emplea todavía como aditivo de los piensos.



Este antibiótico ocupa una posición intermedia ya que se utiliza algo, principalmente en Japón, como conservador alimenticio. Su empleo al parecer, ha sido abandonado. La natamicina es un antibiótico macrólido originado por Streptomyces natalensis; su principal efecto es antifungico y su empleo está permitido en ciertos países. In vitro inhibe el desarrollo de hongos productores de aflatoxinas en los cacahuetes crudos triturados. Ello constituye una ventaja considerable, lo que para algunos expertos seria suficiente para superar cualquier objeción acerca del empleo de este antibiótico en los alimentos. Hay varias publicaciones sobre el empleo de la natamicina para inhibir el desarrollo fúngico de los embutidos. Por ejemplo, con concentraciones de natamicina de unas 1000 ppm se conservaron bien, sin sufrir ataques fúngicos, embutidos holandeses. El antibiótico puede aplicarse con salmuera, baños o en forma de "spray" y el embutido puede incluirse en diferentes tipos de tripas. Este tratamiento determinó una concentración superficial de 2 ppm/cm2 que se consideró que no tenía importancia toxicológica. Probablemente la aplicación más importante de la natamicina es para tratar la corteza del queso, tanto blando como duro, mediante la sumersión de aquél en baños, o rociándolo con suspensiones de 500 ppm de natamicina. El antibiótico puede detectarse en la corteza; su penetración varía de acuerdo con el tipo de queso. También se ha empleado la natamicina en las películas de envolver queso; su efecto conservador se pierde si se aplica después de desarrollado el micelio. Ciertos mohos, (A. flavus) producen enzimas en cantidad que inactivan la natamicina




Los antibióticos macrolidos contienen un anillo grande de lactona, pocos dobles enlaces, ningún atomo de nitrógeno y en el anillo uno o más restos azucarados.).  La nisina es un antibiótico originado por estirpes de la bacteria que normalmente corta la leche, el Streptococcus lactis; se presenta naturalmente en la leche ácida y en el queso de granja por lo que es muy posible que desde que se domesticaron las vacas se hayan ingerido pequeñas cantidades de este antibiótico. El empleo de la nisina como conservador alimentario se ha estudiado con profundidad y se ha revisado la mayoría de la bibliografía sobre el tema, no se emplea ni en los piensos, ni en medicina humana o veterinaria; los microorganismos que desarrollan resistencia frente a este antibiótico se ignora si son resistentes a otros. La nisina es un polipéptido que lo inactivan fácilmente los enzimas proteolíticos a pH = 8, por lo que es fácilmente digerido; estudios extensos realizados con ratas a las que se suministró per os durante dos años hasta 8 mg/kg de peso no manifestaron toxicidad alguna. El empleo de la nisina como conservador de alimentos "debería considerarse aceptable siendo la ingesta media diaria incondicional de 0 – 33.000 U/Kg de peso" (WHO, 1969). (Hay unos 40.000.000 de unidades por g de nisina pura; para la conservación de alimentos se recomiendan de 100 a 400 unidades por gramo de alimento (ó 2,5 – 10 ppm). Actualmente se elabora nisina en la URSS, Polonia y Reino Unido y su empleo está permitido en unos 20 países. La nisina posee un pequeño espectro antibacteriano afectando sólo a los gérmenes gram positivos. Puesto que las bacterias gram negativas no son afectadas el empleo de la nisina como conservador de alimentos no puede contrarresar a una mala higiene; su escaso espectro antibacteriano y su estabilidad ácida determinan unas condiciones de aplicación especiales. Sólo puede emplearse eficientemente cuando los microorganismos alterantes nisina sensibles son prácticamente los únicos presentes en el alimento. Este es el caso por ejemplo, de los clostridios que originan hinchamiento en el queso suizo.



No obstante y por otras razones, este proceso apenas se utiliza en la práctica; el antibiótico es también termoestable especialmente en condiciones de acidez; de aquí que la nisina se pueda emplear como adyuvante del tratamiento térmico. El calor aplicado puede reducirse a sólo el necesario para destruir Clostridium botulinum que es el anaerobio esporulado más nisin-resistente. Este menor tratamiento térmico mejora la calidad del producto alimenticio; además estos productos presentan mejores condiciones de almacenamiento, especialmente a temperaturas ambientales altas. En el proceso combinado calor-nisina, esta evita el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico. Sin embargo a las concentraciones corrientemente utilizadas, 100 U/g, la nisina no parece que sea esporicida; por lo tanto, el proceso debe planificarse de forma que quede suficiente cantidad de nisina después del tratamiento térmico y durante el almacenamiento para asegurar la continúa inhibición del crecimiento de las esporas.
Cuando la legislación lo permite la nisina no sólo se emplea para prevenir el abombamiento de los botes sino también para conservar el queso procesado y el chocolate con leche. Otras industrias alimenticias la emplean para conservar guisantes, alubias en salsa y capsuts.



El suministro de antibióticos ha permitido también el desarrollo de unas condiciones de cría intensivas y superpobladas que caracterizan a las modernas técnicas de explotación animal.  Pronto se puso de manifiesto la preocupación por el desarrollo de resistencia de la microflora de los animales a los que se suministraban antibióticos. La ganancia en peso vivo atribuible a los bajos niveles de antibióticos suministrados con el pienso durante periodos grandes de tiempo no ha variado. No obstante, el aumento de la incidencia de microorganismos antibiótico-resistentes ha causado preocupación. La existencia de microbios resistentes se conoce desde el trabajo pionero de Paul Erlich a comienzos de siglo; pensó que estas bacterias se convertían en resistentes por una mutación cromosómica espontánea o por la selección, en presencia del agente químico terapéutico, de las bacterias resistentes ya existentes en la población microbiana. La resistencia de tipo cromosómico es específica de un grupo de antibióticos relacionados entre sí. Un nuevo desarrollo en la historia de la resistencia bacteriana fue el descubrimiento de los investigadores japoneses de resistencia múltiple a fines de los años 1950; las bacterias pueden convertirse en resistentes simultáneamente a varios grupos de antibióticos no relacionados entre sí (véanse las revisiones de Watanabe, 1963 y Falkow, 1975). La resistencia múltiple se adquiere por transferencia desde un microorganismo resistente a otro sensible, de un elemento genético, llamado plásmido; existe independientemente del cromosoma bacteriano y en un mismo microorganismo puede haber uno o varios tipos diferentes de plásmidos. El relacionado con la antibiótico – resistencia microbiana se ha llamado también factor de resistencia (factor R) y la bacteria que lo posee suele denominarse R+.


Los plásmidos, como los cromosomas, se componen de moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA); los plásmidos R más grandes representan el 1 – 2 % de la información genética total de las bacterias. La transferencia puede tener lugar entre miembros de especies distintas; por ello los factores R son especialmente importantes en las enterobacterias en las que existe la posibilidad de que se transfiera antibiótico resistencia de un Escherichia coli no patógeno a una Salmonella patógena. Todos los géneros de enterobacterias pueden contener factores R. También poseen plásmidos de resistencia las pseudomonas y los estafilococos y estreptococos. Es posible que tal transferencia de factores R ocurra en condiciones naturales entre las bacterias que pertenecen a la misma familia. Se admite ahora generalmente que la mayoría de las "resistencias" de las bacterias de tipo salvaje se deben a factores R y no son del tipo cromosómico.  El concepto que de ello emerge es el de un sistema ecológico común al hombre y animales. Los problemas de transferencia de factores R de las bacterias patógenas a las inocuas y el consiguiente miedo a que falle la terapéutica antibiótica humana, especialmente en el caso de resistencia antibiótica múltiple ha llevado al establecimiento de comisiones de encuesta. Quizá las más importantes sean el Comité Swabb del Reino Unido y la Task Force de la Administración de Alimentos y Medicamentos (departamento de Salud, Educación y Bienestar de los EEUU. FDA., US. Department offlealth, Education and Welfare). En general ambas comisiones estudian el problema bajo los mismos puntos de vista, pero las recomendaciones y la legislación de ambos países difieren apreciablemente. 



Ni el comité Swann, ni la Task Force encontraron pruebas que demostrasen que los residuos de antibióticos de los productos originados por animales que habían recibido con el pienso cantidades subterapéuticas de antibióticos fuesen tóxicos para el consumidor. Además tampoco pudieron comprobar que tales productos contribuyesen a las reacciones alérgicas de personas que se hubieran sensibilizado previamente a los mismos.  De otra parte ambas comisiones se mostraron preocupadas porque las formas antibiótico-resistentes de las bacterias patógenas del hombre pudieran presentarse en los animales y de éstos pasar a la especie humana. Un informe de la OMS (World Health Organization, 1973) hace énfasis en que los beneficios del suministro de concentraciones bajas de antibióticos son demasiado grandes como para considerar su retirada del empleo ganadero.  No obstante, dado que los antibióticos son indispensables para la terapéutica humana y animal, el citado informe los ha ordenado de acuerdo con su mayor peligro. Aquellos que presentan menos peligro son adecuados para su utilización con el pienso, mientras los que presentan gran riesgo no son aptos para este fin. 



A continuación se clasifican los antibióticos empleados con fines terapéuticos, profilácticos o alimenticios en orden creciente de peligrosidad respecto al desarrollo de resistencia bacteriana:

1. Bacitracina, flavofosfolipol (Este es el nombre no registrado de un antibiótico cuya denominación comercial registrada es la de flavomicina), virgmiamicina.
2. Polimixina, furanos, lincomicina, tilosina y macrólidos relacionados con ellos.
3. Eritromicina, espiramicina, oleandomicina.
4. Penicilina, tetraciclinas.
5. Ampicilina, cefalosporinas.
6. Sulfonamidas, estreptomicina, neomicina.
7. Cloranfenicol.

La Comunidad Económica Europea (CEE) reconoció en la década de 1960 el riesgo de suministrar antibióticos que pudieran seleccionar los microorganismos resistentes que albergan plásmidos y desaconsejó el empleo como aditivos del pienso de tetraciclinas, estreptomicina y antibióticos relacionados con ellas. Se prohibió el empleo de la penicilina por el amplio uso que se hace de este antibiótico en medicina humana y animal. En la CEE nunca se han utilizado con fines nutritivos el cloranfenicol, polimixina, ampicilina, cefalosporinas, ni sulfamidas; sin embargo, algunas de éstas siguen utilizándose como coccidiostático en avicultura. Continúan los comentarios sobre si el empleo de los macrólidos, incluida la lincomicina, debería prohibirse en terapéutica animal y en los piensos; algunos antibióticos pueden excluirse de su empleo animal. 




l.  ENVASES Y ENVASADO DE LOS ALIMENTOS

El envasado preserva la calidad de los alimentos y los protege de los daños que pudieran producirse durante el almacenamiento, el transporte y la distribución. La protección ejercida puede ser de tres tipos:

1. Química. El envasado puede impedir el paso del vapor de agua, del oxígeno y de otros gases, o actuar de forma selectiva, permitiendo sólo el paso de algunos de los gases.

2. Física. El envasado puede proteger de la luz, el polvo y la suciedad, de las pérdidas de peso y de los daños mecánicos.

3. Biológica. El envasado puede impedir el acceso al alimento de microorganismos e insectos, afectar el modo o velocidad de la alteración, o la supervivencia y crecimiento de los gérmenes patógenos que pudiera haber en el alimento.


Los envases pueden ser rígidos (latas, papel, cartón, vidrio, plástico) o flexibles (plásticos, hoja de aluminio). Los plásticos son cada vez más utilizados. Mediante diversas combinaciones de materiales y técnicas de procesado, es posible producir envases con cualquiera de las propiedades funcionales que se consideren deseables. Los componentes e impurezas de los materiales de envasado y sus adhesivos, no deben poner en peligro la salud humana ni reaccionar con el alimento o adulterarlo. El material de envasado no debe contener microorganismos patógenos que puedan introducir un riesgo para el consumidor. Por ejemplo, la presencia de salmonellas en un material de envasado que vaya a usarse para un plato precocinado y congelado, sería inaceptable.  Sin embargo, no habría razón para preocuparse excesivamente por la presencia de unos cuantos esporos de Clotridium perfringens en el material utilizado para envasar especias deshidratadas, porque de cualquier manera, es fácil que existan esos mismos esporos en la misma especie. Tampoco debe el material de envasado introducir cantidades importantes de microorganismos causantes de alteración.  



Se ha desarrollado un procedimiento que mediante un sencillo chorro de vapor, sirve para descontaminar los recipientes empleados para cocer jamones. Muchos países imponen standards microbiológicos para controlar la contaminación superficial de botellas y otros recipientes reutilizables; una contaminación superficial de sólo 10 microorganismos por 100 cm2 equivale a "muy limpio". En papel sin tratar, se ha podido observar que predomina el género Bacillus y a veces los micrococos, a niveles normalmente inferiores a los 200/gramos, aunque a veces se llega hasta 2800/g; en otro estudio similar, se encontraron mohos y levaduras a niveles de hasta 10 por 100 cm2En Estados Unidos, el papel para envasado de alimentos no debe sobrepasar los 250 organismos por gramo y los recipientes y tapas para leche, no más de uno por cm2. Se ha propuesto un método standard para la determinación del recuento de bacterias, mohos, levaduras y gérmenes coliformes en materiales de envasado no absorbentes. Los niveles de bacterias en la superficie de hojas de aluminio utilizadas para el envasado de alimentos, son aún menores. Los tubos y películas de plástico suelen tener entre 1 y 20 microorganismos por cada 1000 cm2 y normalmente no llegan a los 10. En los vasitos de plástico, los valores encontrados son del mismo orden. Sin embargo, algunos microorganismos sobreviven incluso a la extrusión a 220ºC de los plásticos. A veces, se presta demasiada importancia a la contaminación microbiana aportada por el material de envasado; en general, los niveles de microorganismos contenidos en el producto son varios órdenes de magnitud mayores de los que existen en el material de envasado. Al no poder ser degradados por la acción microbiana, el poliestireno y otros plásticos, son más higiénicos que el papel prensado u otros derivados de la madera para el envasado de huevos (Pfeiffer,1972), carne (Bólime, 1971) o frutos en baya (Ayres y Denisen, 1958). Algunos plásticos tienen propiedades antibacterianas; es el caso de los que contienen alquido-barnices, resinas fenólicas, cloruro de polivinilo o poliacetal (Gundermann y Glück, 1971). Sin embargo, antes de escoger un material de envasado por sus propiedades antimicrobianas, conviene asegurarse de que no va a adulterar el alimento.




El material de envasado debe impedir la entrada de los microorganismos; las botellas, latas y la mayoría de las películas de plástico actualmente en el mercado, cumplen esta función.  Se produce penetración cuando falla el sellado o se perfora el envase; por eso, el material ha de tener la suficiente resistencia mecánica como para impedir que se produzcan daños durante el procesado y la manipulación posterior. El mismo contenido puede también dañar el envase: es el caso de los huesos afilados de aves y otras carnes, y de las fibras de músculo o trozos de piel en alimentos muy desecados o ahumados. Una prueba biológica es lo mejor de determinar si una película resistirá a la penetración; se sumerge una porción estéril de un medio nutritivo empaquetada con el material en cuestión y sellada, en un baño que contenga el microorganismo concreto que interese (por ejemplo, Enterobacter) o una mezcla de microorganismos. La presencia de gas o la turbidez en el medio indicará que se ha producido penetración. Para el ensayo de laminados de plástico y aluminio resistentes al calor, se ha recomendado la "prueba de ebullición en agar", en la que los envases se hierven durante 45 minutos en agar al 2 %. Antes de que se enfríe el agar, se añaden esporos de Bacillus stearothermophilus y durante el enfriado, el medio inoculado pasa a través de los puntos de penetración.  Varios autores han demostrado que algunos microorganismos pueden atacar los materiales de envasado sintéticos y, en condiciones favorables, pueden atravesar una película no dañada previamente. En algunos casos, se requiere una exposición prolongada a los enzimas bacterianos para que sea posible la entrada.



Por ejemplo, los microorganismos productores de celulasa, sobre todo los mohos, no atraviesan las tripas de hidrato de celulosa de los embutidos, más que al cabo de mucho tiempo a temperaturas relativamente altas. Las películas de plástico tienen muy variada permeabilidad a los gases. La exclusión del oxígeno disminuye la velocidad de oxidación del producto, hace más lento el crecimiento de muchos tipos de bacterias y levaduras e impide el crecimiento de los microorganismos aerobios estrictos (como los mohos, por ejemplo). La alta permeabilidad al oxígeno del poliestireno y las poliolefinas, puede ser reducida combinando estos polímeros con otros materiales mediante barnizado, encolado, recubrimiento o superposición con una capa del otro material o por coextrusión de ambos materiales. de forma análoga, se puede reducir la permeabilidad al vapor de agua de un material; la alta permeabilidad del hidrato de celulosa, por ejemplo, puede reducirse mediante barnizado. El factor más importante de la microbiología de los alimentos envasados es la permeabilidad relativa del material de envasado para el oxígeno, el dióxido de carbono y el vapor de agua, particularmente si los espacios con aire en el producto original han sido evacuados o rellenados con gases preservantes en el momento de cerrar el envase, y sobre todo, si se trata de productos perecederos, tales como aves, carnes y pescados.  Los envoltorios permeables al vapor de agua y a los gases, o más permeables al oxígeno que al dióxido de carbono y aquellos que no se ajustan a la superficie del producto, pueden evitar la entrada de microorganismos contaminantes, pero no afectan al crecimiento de los microorganismos que previamente se encontraban en el alimento. Las condiciones intrínsecas de un alimento envuelto en un material muy permeable, son similares a las del producto sin envolver. Por ejemplo, las películas de celulosa permeables al oxígeno no impiden que crezcan las Pseudomonas en la carne picada, mientras que las películas impermeables a los gases lo hacen imposible. Las películas de materiales que como el polietileno, son impermeables a la humedad y permeables al oxígeno, sirven para proteger de la contaminación y de las pérdidas de agua, pero más que frenar, estimulan el crecimiento en superficie de la flora normalmente causante de alteración. El crecimiento y la actividad de los microorganismos dentro de un envase depende de: a) la idoneidad del alimento como medio de cultivo, b) la temperatura, c) la aw, d) el pH, e) la naturaleza de los gases retenidos dentro del envase y f) la competencia entre microorganismos. 





ll.  LOS GASES COMO CONSERVADORES

Desde hace muchos años se sabe que diversos gases y vapores naturales, o artificialmente producidos, destruyen o inhiben a los microorganismos. Algunos de ellos se han estudiado para conocer su capacidad potencial de aumentar la vida útil de los alimentos. De estos, sólo se discutirán con detalle los que se han utilizado comercialmente: dióxido de carbono, óxido de etileno, óxido de propileno, dióxido de azufre y ozono. El nitrógeno y el oxígeno se utilizan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de alimentos pero su fin primario no es la inhibición de los microorganismos. El nitrógeno líquido, cuando se utiliza en los alimentos como un agente frigorífico, inhibe o destruye indirectamente a los microorganismos por congelación o refrigeración. El oxígeno se utiliza en atmósferas controladas para mantener el estado fisiológico de las frutas, hortalizas y verduras y el característico color rojo de la carne fresca pero no se aplica con el fin de inhibir los microorganismos responsables de la alteración. Diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con éxito en la desinfección de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo pero no se han aplicado a los alimentos. Entre ellos están la ß – propiolactona, la clorpicrina, el glicolaldehído, el glutaraldehido y el ácido peracético. Aunque el bromuro de metilo se ha utilizado eficazmente, como fumigante, en las frutas y granos infestados por insectos, no se ha empleado específicamente para controlar los microorganismos en los alimentos.



El formaldehído se ha utilizado como fumigante en la desinfección de gallineros y huevos para incubadoras pero igualmente no directamente para el control de los microorganismos en los alimentos. El formaldehído realmente ejerce una acción letal sobre los microorganismos de la carne y del pescado durante el ahumado pero como el calor y la desecación están también implicados en el proceso, su contribución real a la inhibición de los microorganismos es desconocida. Investigaciones recientes han mostrado que el monóxido de carbono y el acetaldehído son potencialmente útiles para su uso en los alimentos. Un uno por ciento de monóxido de carbono prolonga el color de la carne fresca y tiene un efecto inhibidor sobre las bacterias psicrotrofas, similar al del dióxido de carbono. Los vapores de acetaldehído al 0,5 % en la atmósfera inhiben, de una forma acusada, los mohos y levaduras aumentando el tiempo de conservación de las frutas, hortalizas y verduras. El dióxido de carbono, gas a las temperaturas normales de almacenamiento, es incoloro, inodoro e incombustible. No es tóxico para el hombre a concentraciones inferiores a un 10 % pero por encima de este nivel una exposición prolongada a la acción del mismo da lugar a la pérdida del sentido, lo que es importante tener en cuenta cuando se utilice a altas concentraciones en los grandes almacenes y vehículos de transporte. No deja residuos tóxicos ni su aplicación presenta serios problemas mecánicos. El gas se comercializa habitualmente, en forma líquida, en bombonas de acero a una presión de 58 Kg/cm2 (830 lb/pulgada2) aproximadamente o en forma sólida como nieve carbónica. A presión atmosférica, la forma sólida se transforma en gas sin pasar por el estado líquido, sublimándose a -78,5ºC a la presión normal. Para la manipulación de la nieve carbónica deben utilizarse guantes ya que el contacto momentáneo con la piel a -78,5ºC puede causar quemaduras por congelación y ampollas.



El dióxido de carbono se disuelve bien en agua (1,71 ml CO2/ml H2O a 760 mm de presión y a 0ºC) y, por tanto, en los zumos de frutas pero la absorción parece ser un fenómeno totalmente físico que implica una unión no más intensa que la del ácido carbónico. Cuando se absorbe en los alimentos, el pH baja de acuerdo con la cantidad de ácido carbónico que se forma y con la capacidad tampón del alimento pero de nuevo aumenta cuando el CO2 se elimina por exposición al aire o por un calentamiento suave del producto. El dióxido de carbono destruye, estimula, inhibe o no tiene efecto alguno de resaltar sobre los microorganismos, dependiendo de los microorganismos, de la concentración de dióxido de carbono, de la temperatura de incubación, de la edad de las células microbianas en el momento de aplicar el CO2 y de la actividad de agua del alimento o medio de cultivo. De todos estos efectos, los de mayor importancia en relación con el procesado y conservación de los alimentos son, sin duda, los destructivos e inhibidores. Existe una considerable variación en lo referente a la sensibilidad al CO2 a nivel de género, especie y cepa. Por ejemplo, el CO2 al 100 % destruye totalmente, tras una exposición de 4 días a temperatura ambiente, a algunos cultivos de Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium y Micrococcus mientras el efecto es nulo o escaso sobre Proteus spp., Clostridium perfringens y algunos tipos de Lactobacillus. 



Por tanto, aunque la acción del CO2 sobre los microorganismos es selectiva, la mayoría de las levaduras, mohos y algunas bacterias son inhibidos por concentraciones comprendidas entre 5 y 50 % (viven la fase gaseosa) pero no son destruidos o inhibidos totalmente. Concentraciones inferiores a aquellas no tienen efecto alguno o realmente estimulan el crecimiento. La inhibición aumenta de una forma casi lineal cuando se incrementa la concentración de CO2 desde un 5 % hasta el 25 - 50 %, dependiendo siempre del alimento y de la flora implicada. A concentraciones superiores a ésta el incremento de la inhibición es escaso o nulo. Aunque el grado de inhibición varía con los microorganismos y el alimento, con un 10 % se logra habitualmente una inhibición del orden del 50 % sobre la base del recuento total después de un determinado tiempo de incubación. El efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos en los alimentos parece mayor a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento según se deduce del aumento relativo de la vida útil del alimento al descender la temperatura de almacenamiento. Sin embargo, cuando los efectos de la temperatura y del CO2 se estudian por separado, se observa que la acción del CO2 se incrementa al aumentar la temperatura. El efecto inhibidor del CO2 se manifiesta, tanto en las bacterias como en los hongos, por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generación durante la fase logarítmica. No obstante, a concentraciones comprendidas entre el 5 y el 20 %, el efecto mayor se logra en la fase de latencia. La aplicación de gas una vez que las células microbianas ha empezado a adaptarse al medio, o cuando ya están en la fase logarítmica, el efecto del CO2 se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en estudios realizados con cepas psicrotrofas del género Pseudomonas y del grupo Acinetobacter – Moraxella se comprobó que si se retrasa la aplicación del CO2 (20 %) hasta 1 ó 2 días después de la inoculación sobre la superficie de la carne, el efecto inhibidor es menor. Sin embargo, si la concentración de CO2 era del 40 % el momento en que se expone el producto a la atmósfera de CO2 tiene una influencia menor.



La velocidad de crecimiento en atmósfera de CO2 no aumenta con el tiempo, es decir, la inclinación de la curva de crecimiento no cambia. Esto indica que el sistema metabólico no se adapta durante la fase de exposición al CO2 ni existe, en este caso, una selección de los microorganismos CO2 -resistentes. La reducción de la actividad de agua del medio aumenta el efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos. El mecanismo de inhibición de los microorganismos por el CO2 no se conoce todavía con claridad. Sin embargo, ya en 1889 se observó que se debía a la presencia real de dióxido de carbono y no a la ausencia de oxígeno y que el efecto es reversible, ya que los microorganismos tratados recuperan la velocidad de crecimiento normal cuando se dejan de exponer a la atmósfera de CO2. No obstante, en el caso de los microorganismos que alteran la carne, permanecen efectos inhibidores residuales cuando el gas se ha dejado de aplicar. El efecto directo del gas sobre las células microbianas se confirmó muchos años más tarde en experimentos realizados con Pseudomonas aeruginosa. El descenso del pH debido a la formación de ácido carbónico en el medio tiene un efecto perjudicial sobre ciertos microorganismos; por ejemplo, una atmósfera de CO2 al 20 % puede hacer bajar el pH, si el medio no está tamponado, en un valor de hasta una unidad de pH de 6,9 a 5,8.  Sin embargo, los experimentos con medios tamponados y con alimentos intrínsecamente tamponados como la carne han mostrado que el pH externo a la célula microbiana no explica totalmente el efecto adverso del CO2.






"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HÁBITO"

ARISTOTELES







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