NUEVA GUÍA PRÁCTICA del LABORATORIO MICROBIOLÓGICO de AGUAS y ALIMENTOS (XV Parte)
“El médico del futuro no tratará el cuerpo humano con medicamentos, más bien curará y prevendrá las enfermedades con la nutrición"
(Thomas Alva Edison)
NUEVA GUÍA PRÁCTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO
de AGUA y ALIMENTOS (XV Parte)
ARISTOTELES
Salmonella
y Shigella
El aislamiento e identificación de
Salmonella sp. es un proceso complejo que consta de varias fases; el recuento
generalmente no se practica. Una vez tomada la muestra del alimento (25 g,
según lo normatizado en el CAA) se mezcla con un medio de preenriquecimiento,
como el caldo lactosado en una cantidad de 225 ml. Este paso podría llegar a
obviarse con aquellos alimentos que ya contengan lactosa en su composición
(farináceos, pastelería, etc). El caldo se incuba entonces unas pocas
horas (8) a 37 ºC para facilitar la recuperación de las salmonelas lesionadas.
La segunda fase implica la siembra de una muestra de caldo en un medio de
enriquecimiento que favorezca el crecimiento de las salmonelas a la vez que restringe
o inhibe por completo el desarrollo de microorganismos competidores, como los
coliformes. El término enriquecimiento selectivo se usa con carácter general
para indicar que a un microorganismo o a un grupo de ellos se le permite crecer
mientras que se inhiben los competidores; en esencia en esta fase se busca que
aumente la proporción del microorganismo(s) requerido(s) respecto a todos los
competidores. Los dos medios de
enriquecimiento corrientemente utilizados con las salmonelas son el Caldo de Selenito
– Cistina y el Caldo Tetrationato. El primero contiene selenito sódico, como
agente inhibidor, aunque la hidrólisis de la lactosa que también forma parte
del medio y que llevan a cabo muchas de las bacterias entéricas presentes, da
lugar a una caída del pH que favorece el crecimiento de las salmonelas.
El caldo de tetrationato contiene varios
agentes inhibidores como sales biliares, verde brillante y tetrationato que, en
combinación, permiten que crezcan las salmonelas mientras que se inhiben eficazmente
la mayoría de sus competidores. La incubación de estos caldos se realiza a 37º
C durante 24 horas. Después del enriquecimiento los caldos se
emplean como inóculo de placas de medios selectivos, habiéndose empleado con
este fin, tanto Agar SS como Agar-rojo violeta-bilis. No obstante, ahora se
usan generalmente agar de MacConkey-verde brillante y agar
desoxicolato-citrato; ambos contienen diversos agentes selectivos, los
nutrientes usuales, lactosa y un indicador de pH. Las salmonelas al no fermentar la lactosa forman en
estos medios después de una incubación de 24 horas a 37º C, colonias verdes e
incoloras, respectivamente y por lo tanto se distinguen fácilmente de las
colonias rojas originadas por los microorganismos fermentadores de la lactosa.
Desgraciadamente muchos otros microorganismos dan en estos medios colonias
indistinguibles de las de Salmonella sp., por lo que se necesitan otras pruebas
antes de confirmar su aislamiento. La confirmación se realiza picando las
colonias sospechosas y después de comprobada su pureza se resiembran en medios
para comprobar la fermentación de otros carbohidratos, la producción de ácido
sulfhídrico, la descarboxilación de la lisina y la motilidad.
Con tal que estas pruebas de tamizado
(screening) produzcan los debidos resultados, las bacterias aisladas pueden
considerarse como salmonelas, llevando a cabo la confirmación final con pruebas
serológicas. La
caracterización del serotipo específico puede hacerse con los correspondientes
antisueros H y O, si bien para la confirmación suele ser suficiente con el
empleo de antisueros polivalentes H y O (que son representantes de todos los
serotipos que generalmente cabe esperar). Es probable que los concentrados
de muestras necesiten ser enriquecidos previamente en agua de peptona
amortiguada, para luego ser enriquecidos en caldo que contenga ya sea
tetrationato, selenito, cloruro de magnesio o verde de malaquita. Estos, a su
vez, pueden ser sometidos a subcultivo en medios como el verde brillante,
sulfito de bismuto, agar de desoxicolata xilosa-lisina (DXL), citrato de
desoxicolata o agar de MacConkey, examinándose luego las colonias sospechosas
tanto bioquímica como serológicamente. Entre las pruebas de depuración
bioquímica se deberá incluir: agar triple de azúcar y hierro, producción de
indol, decarboxilasa y actividad de ß-galactosidasa. En las pruebas serológicas
se incluirá la aglutinación con sueros polivalentes anti-o, anti-H y anti-Vi.
Es imprescindible la eliminación previa
de cepas autoaglutinables. Cuando el análisis se realiza para detectar
las S. typhi , el
medio de cultivo aconsejado es la selenita F. El procedimiento de los tubos
múltiples se utilizará para calcular el número de Salmonella presentes en el agua. Debido a que las bacterias coliformes y la mayoría de
cepas de Proteus vulgaris son
antagónicas a la Shigella,
es aconsejable elegir medios enriquecidos selectivos que reduzcan al mínimo las
acumulaciones de compuestos volátiles y de los subproductos obtenidos a partir
de estos microorganismos antagónicos. Se puede usar caldo nutriente con un pH
ajustado de 8,0 (es el nivel de pH que menos favorece el crecimiento de
bacterias coliformes). También es posible obtener un buen enriquecimiento
de Shigella con un
medio de cultivo autocitotóxico con base en caldo de tripticasa de soja
conteniendo 1 mmol/litro de 4-cloro- 2-ciclopentilfenil ß-D-galactopiranosida,
2,5 g/litro de lactosa y sustancia amortiguadora de citrato a un pH de 6,2. La
incubación debe hacerse durante 6-18 horas, a una temperatura de 35°C.
Estríense las culturas en agar DXL cuando hayan transcurrido 6 y 18 horas.
Sométanse las colonias sospechosas a pruebas de selección bioquímica y
confírmese las colonias sospechosas con antisueros de Shigella (sueros polivalentes y
de tipo).
La presencia en alimentos de cualquier
serotipo de Salmonella es potencialmente peligroso como fuente de enfermedad
para el hombre, bien por consumo de los alimentos o por contaminación
secundaria de utensilios y equipo para el tratamiento e industrialización de otros
productos. La norma
microbiológica vigente para diversos alimentos (jamón cocido, fiambre de jamón,
paleta cocida, fiambre de paleta, magro de cerdo cocido, fiambre de magro de
cerdo, gelatinas comestibles, huevo entero pasterizado refrigerado o congelado,
yema pasterizada refrigerada o congelada, huevo entero desecado, yema desecada,
clara desecada, leche y productos lácteos, nata, etc.) exige la ausencia de
Salmonella en 25 g.
a) Enriquecimiento en medio líquido no
selectivo. Homogeneizar 25 g de la muestra con 120 ml de agua de peptona
estéril, e incubar a 37ºC durante 12-24 horas.
b) Enriquecimiento en medio líquido
selectivo. Pasar 10 ml del homogeneizado anterior a un frasco que contenga 100
ml de caldo tetrationato (Müller-Kauffmann). Incubar a 37ºC durante 24 horas.
Para detectar ciertos serotipos que pueden no crecer adecuadamente en las
condiciones anteriores, puede realizarse un enriquecimiento selectivo
complementario en otro medio (generalmente caldo selenito cistina) incubando y
también a una temperatura distinta (43ºC).
c) Siembra en medios sólidos selectivos.
Pasar un asa de siembra del caldo de enriquecimiento a sendas placas de medio
selectivo (agar SS Salmonella-Shigella y agar XLD) y extender el inóculo.
Incubar a 37ºC durante 24 horas.
d) Estudio de las colonias sospechosas.
En agar SS las colonias típicas son incoloras y el medio vira a amarillo, en
agar XLD son rojas y transparentes. Algunas cepas dan colonias con el centro
negro.
e) Uilización de
glucosa y lactosa. De las colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se
siembra en superficie en un tubo de agar Kligler incubándose a 37ºC durante 24
horas. La coloración amarilla en el fondo indica la utilización de glucosa,
mientras que la de la superficie indica la de lactosa. El fondo negro refleja
la presencia de H2S.
f) Utilización de manitol. De las
colonias sospechosas (del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un
tubo de agar Manitol incubándose a 37ºC durante 24 horas. La coloración
amarilla indica la utilización de ese azúcar.
g) Ureasa. De las colonias sospechosas
(del agar SS o del XLD) se siembra en superficie en un tubo de agar Urea
incubándose a 37ºC durante 24 horas. La presencia de color rosa indica
resultado positivo. Se consideran
Salmonella las colonias glucosa + y lactosa - en los tubos de agar hierro de Kligler (con o sin fondo negro), manitol + y que además sean negativas a las
otras pruebas bioquímicas.
Salmonella pertenece a la Familia
Enterobactereaceae, al Género Salmonella. Salmonella y Arizona por la homología
de su DNA se le considera una sola; la nomenclatura y clasificación no está
establecida definitivamente. Bacilo GRAM (-) aerobio y anaerobio facultativo,
producen ácido a partir de la glucosa y son generalmente aerogénicos. Se distinguen 7 distintos subgrupos, cada cual con su
fenotipo definido y son serotipificados por antígeno O somático,Vi de
superficie y antígenos flagelares fase I y II. Según última clasificación,
se establece la siguiente nomenclatura estimándose que el 99% de los aislamientos en clínica corresponde a al subgrupo I. El período de
incubación de la enfermedad es desde las 6 hasta 48 hrs dependiendo de la dosis
infectante la que puede ser desde 15 a 20 UFC para algunos serotipos. No todos los serotipos son patógenos para
el hombre y animales. La incidencia de salmonelosis se ha visto incrementada en
los últimos 20 años estimándose que los casos anuales van desde 740.000 a 5.000.000
de los cuales no más del 1% es detectado. Los
factores más importantes para su control pasa por una adecuada educación al
consumidor y por la implementación y mantención de adecuados controles de
calidad por parte del laboratorio de la industria de alimentos la que
preferentemente utiliza métodos rápidos para realizar screening en sus
productos mediante kits rápidos los que son eficientes en detectar partidas
negativas pero en el caso de reacciones presumiblemente positivas se debe
confirmar con los métodos convencionales.
Una de las fuentes principales son los
alimentos contaminados con éste microorganismo especialmente los alimentos de
origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas. Los alimentos se analizan para pesquisar Salmonella por
las siguientes razones:
a. Confirmar que este microorganismo fue
el agente causal de la intoxicación alimentaria.
b. Determinar qué alimentos o
ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Salmonella.
Es la segunda causa más común de enfermedades
transmitidas por alimentos. Es responsable de millones de casos al año de
enfermedades transmitidas por alimentos; Origen: huevos crudos y mal cocidos,
pollos y carnes mal cocidas, productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales.
Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son:
-carne (vacuno, cerdo, pollo),
-productos cárneos (jamón, salame,
vienesas),
-ensaladas (papas, porotos verdes, jamón,
pollo),
-productos de pastelería (cremas) y
-productos lácteos (queso, queso de
cabra, etc).
Staphylococcus aureus
Los métodos para el examen de S. aureus
pueden agruparse en dos: primero recuento de estafilococos y segundo
comprobación de la presencia de enterotoxina en el alimento. Dado que sólo un
50 % aproximadamente de las cepas de S. aureus son enterotoxigénicas, se deduce
que en la investigación de brotes de toxiinfecciones alimentarias el segundo
método es más concluyente; además, a partir de ciertos alimentos corrientemente
se aísla un pequeño número de S. aureus sin que ello debe considerarse
peligroso. El rango de medios selectivos, a base de
agar, que se ha utilizado para la enumeración de S. aureus en los alimentos es
especialmente grande y como en el caso de C. perfringens, la ICMSF ha realizado
un estudio comparativo de algunos de los más empleados (Rayman et al., 1978).
Concluyó que el Agar de Baird – Parker era el que mejor se comportaba. Este
medio (Baird – Parker) contiene como agentes inhibidores telurito potásico y
cloruro de litio y como sistema indicador yema de huevo. Previamente el inóculo
se lleva a un medio preselectivo como lo es el Caldo Giollitti – Cantoni
adicionado con telurito de potasio como inhibidor, incubándose 24 hs a 37° C.
Después de 24 – 48 horas de incubación a
37º C, S. aureus produce en el medio colonias negras rodeadas de una zona clara
(de 2 – 5 mm de anchura); en el interior de esta zona hay otra opaca más
pequeña que sólo se desarrolla en la última fase de la incubación. Estas
reacciones son muy específicas de S. aureus, pero debe hacerse una prueba
confirmativa (reacción de la coagulasa). La detección de enterotoxina en los
extractos de alimentos o en los filtrados de cultivos aislados de los alimentos
sospechosos implica normalmente procedimientos serológicos que son más
sensibles y más baratos que las pruebas previamente utilizadas. Dado que las
concentraciones de enterotoxina en los alimentos son muy bajas deben emplearse
métodos de extracción y concentración; puesto que estas técnicas requieren
mucho tiempo, últimamente se han introducido técnicas más rápidas. Los métodos
de hemaglutinación y radioinmunoensayo dan los resultados en pocas horas y
además no necesitan que se concentren los extractos de los alimentos.
S. aureus
pertenece a la familia Micrococcaceae, al Género Staphylococcus. El género
Staphylococcus está constituido por diecinueve especies y se diferencian de
otros géneros de la familia, en base al contenido de guanina y citosina (G + C)
en el DNA, composición de la pared celular y su habilidad de crecer anaeróbicamente
y fermentar la glucosa bajo esas condiciones (Bergdoll, 1979, Kloos y
Schleifer, 1986).
Las tres especies más conocidas de
Staphylococcus
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Se diferencian por su capacidad
para:
* producir coagulasa
* fermentar el manitol (aeróbica y
anaeróbicamente),
* producir una nucleasa termoestable
* composición de la pared celular
S. aureus es una bacteria inmóvil, Gram
positiva, esférica y usualmente agrupada en racimos, anaerobia facultativa,
catalasa positiva. Produce generalmente la enzima coagulasa, fermenta el
manitol y otros azúcares, formando ácido pero no gas.
El crecimiento ocurre en un amplio rango
de temperatura 6,5 a 50ºC, siendo el óptimo 30-40ºC.
Los Staphylococcus son microorganismos
que viven en estrecha relación con el hombre y la gran mayoría de las cepas son
potencialmente capaces de causar enfermedad. Staphylococcus aureus es un
microorganismo fácilmente destruido por tratamientos térmicos con altas
temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de
esta bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente
indica falta de sanitización o contaminación cruzada.
Los alimentos se analizan para investigar
S.aureus por las siguientes razones:
* Confirmar que este microorganismo fue
el agente causal de la intoxicación alimentaria.
* Determinar qué alimentos o ingredientes
de alimentos son fuente de contaminación de Staphylococcus aureus.
* Demostrar contaminación post proceso
los cuales usualmente se deben a contacto humano con alimentos procesados o
exposición del alimento a superficies inadecuadamente sanitizadas.
Los alimentos comúnmente asociados a
intoxicaciones son:
- carne (vacuno, cerdo, pollo),
- productos cárneos (jamón, salame,
vienesas),
- ensaladas (papas, porotos verdes,
jamón, pollo),
- productos de pastelería (cremas)
- productos lácteos (queso, queso de
cabra, etc)
El objetivo de realizar análisis de
Recuento de S. aureus es detectar el número de unidades formadoras de colonias
(UFC) y el de realizar NMP es estimar la densidad de bacterias S. aureus en un
alimento como indicador sanitario. Se aplica el método de recuento en placa en
alimentos en los cuales se puede detectar > 100 células /g o ml. Se aplica
la técnica NMP en productos en los cuáles el número de S. aureus es bajo, como
por ejemplo en alimentos deshidratados o congelados. También es útil en
alimentos que contengan una gran población de especies competitivas. Aunque el género Staphylococcus está integrado por un amplio número de
especies con posibilidad de producir enterotoxinas es indudable que S. aureus es con mucho la que
presenta un mayor porcentaje de cepas enterotoxigénicas y por lo tanto
productoras de intoxicaciones por alimentos. La presencia de estafilococos en
alimentos puede deberse a una procedencia endógena como consecuencia de
infecciones de origen animal, o exógena, a partir de manipuladores
fundamentalmente. La investigación de los brotes de intoxicación estafilocócica
diagnosticadas en los últimos años señala que la procedencia humana de estos
procesos es más frecuente que la animal.
Procedimiento: Preparar un homogeneizado
del alimento (10 g) en agua de peptona (90 ml) como se ha descrito para los
recuentos de microorganismos viables. Pipetear 0,1 ml del homogeneizado inicial
(1/10) y de la dilución 1/100 y depositarlo en la superficie de sendas placas
de Petri con el medio de Baird-Parker solidificado. Extender con varilla de
vidrio previamente esterilizada por inmersión en alcohol y posterior
flameado. Incubar a 37ºC
durante 24 – 48 h y contar el número de colonias que aparecen en las placas. Se
consideran estafilococos sospechosos de ser enterotoxigénicos los que dan
colonias de color negro, convexas y rodeadas de un halo más claro en el medio
de Baird-Parker.
Pruebas confirmativas para estos
microorganismos son la prueba de la DNAsa y la de la coagulasa. La
desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patógenas de
S. aureus. A partir de las colonias típicas crecidas sobre Baird-Parker se
siembra una estría sobre la superficie del agar DNAsa. Se incuba durante 24
horas a 37ºC. Sobre el crecimiento se vierte HCl 1N y se espera unos minutos a
que se produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona
transparente alrededor del crecimiento. En
un tubo de 10 x 75 mm se vierten 0,3 ml de plasma de conejo EDTA reconstituido.
Se le añade una colonia típica y se observa a partir de los 30 minutos. La
reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.
Bacillus
cereus
En los alimentos sospechosos sólo se
requiere la determinación cuantitativa de B. cereus que, para tener
importancia, debe alcanzar valores grandes. Los medios selectivos empleados
para el recuento de este microorganismo llevan frecuentemente polimixina ya que Bacillus sp., no es afectado por este
antibiótico. A menudo se les incorpora un sistema indicador a base de yema de
huevo y posiblemente manitol, junto con un indicador de pH; B. cereus se
identifica, de forma presuntiva, por la zona opaca que rodea las colonias
después de 24 horas de incubación a 37º C, zona que es igual a la observada en
S. aureus cultivado en medios con yema de huevo. B. cereus no fermenta el
manitol por lo que sus colonias son pálidas, con una coloración púrpura del
agar que las rodea, mientras que las bacterias fermentadoras del manitol dan
unas colonias amarillas.
- Son
bacterias Gram positivas, familia bacillaceae
- Aerobio
y anaerobio facultativo
- Esporulado:
las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de
la célula dan lugar al hinchamiento de esta.
- Crecen
entre los 10° - 48º C, la temperatura óptima es entre 28° - 35º C.
- Generalmente
son móviles con flagelos perítricos.
- Poseen
antígenos somáticos y flagelares y de esporas.
- Las
reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan
reacciones cruzadas con otros géneros.
- Los
antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias
esporas
- pH
= 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95.
- Para
la germinación en el momento que se agota el medio, al final de la fase
exponencial ocurre la esporulación porque son menos exigentes. La
germinación de las esporas es a 30º. Las esporas son moderadamente
resistentes al calor. Resisten 100º durante 5-10 minutos.
Entre las enzimas y toxinas producidas
por ésta bacteria, podemos encontrar: Lecitinasa (fosfolipasa), se
puede detectar porque estos microorganismos dan lugar a una reacción típica de
precipitación cuando crecen en medios con yema de huevo. Es una sustancia que
puede estar relacionada con efectos necróticos de células
intestinales. Hemolisina, produce la lisis de glóbulos rojos, Factor
letal, produce la muerte de conejos cuando se inyectan por vía
endovenosa, Factor de permeabilidad vascular, produce alteraciones en
vasos sanguineos ya que altera su permeabilidad, Toxina necrótica, relacionada
con la lecitina y produce necrosis de las células del epitelio
intestinal, Toxina emética, produce vomitos, Toxina estable a 126º
durante 90 minutos. Estable a pH 2 y 11 durante 2 horas, puede sobrevivir en
los alimentos y Factor del asa ileal de conejo, origina diarrea y salida
de líquido en experimentación. Todas
esta sustancias se producen a lo largo de la fase exponencial o al final de la
misma por las células vegetativas
Bacillus cereus, es:
- Ubicuo
- Se
puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e industrializados
- Cuando
se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica aparente
- Se empezó a asociar a alimentos en los años 50.
- En
los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados pero si
se dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas,
conviene enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración.
- En
la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no
son esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la
posterior germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser
detectado.
- Alimentos
que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras, sopas,
salsas, ensaladas, arroz hervido.
Su poder patógeno se fundamenta en:
- Toxina emética, enterotoxina, la parte activa es una sustancia de bajo peso
molecular (10.000), es estable al calor (resiste 120º C durante 1 hora)
- Factor
del asa ileal de conejo, enterotoxina diarreica, proteína de peso
molecular 38.000 – 50.000, se inactiva por calentamiento a 56º C durante 5
minutos, es termolábil.
Como cuadro clínico clásico de
intoxicación, tendremos:
Síndrome emético, náuseas y vómitos se
producen al cabo de 1 – 5 horas, la diarrea no es tan frecuente.
Síndrome diarreico, período de incubación
de 8 a 10 horas, dolor abdominal y diarrea, la clínica desaparece a las 12 – 24
horas.
En un brote de intoxicación va a ser
fácil identificarla, mientras que cuando se encuentra en número bajo es más
complicado por acciones competitivas. Las colonias aparecen rodeadas de un halo
de precipitación blanco sobre fondo rosa-rojo-violeta, las que fermentan el
manitol de color amarillo, a las 24 horas las colonias son circulares y lisas,
a las 48 horas grandes y rugosas con estrías, nº de colonias x factor de
dilución = nº U.F.C. / g. Las colonias
sospechosas se transfieren a un agar nutritivo y se incuba. Sembramos en agar
para anaerobios sin glucosa ni indicador, sembramos en picadura, se añade
parafina, incubamos a 31º 24 hora, si hay crecimiento es Bacillus cereus. aldo glucosa sin fosfato, prueba de
Voges Proskauer (VP+), detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y
añadir cristales de creatina para que la reacción sea más rápida.
Agar nutritivo glucosa, incubar a 31º
24-48 horas, se realiza la tinción con fucsina y el polihidroxibutirato
(material de reserva) no se tiñe. Caldo nitrato, la prueba es positiva si hay
transformación del nitrato en nitrito. Movilidad, se siembra en agar en un medio
semisólido en picadura, si el microorganismo es móvil crece por todo el medio. Se puede calcular el NMP cuando se
sospecha que el alimento tenga menos de 10 UFC/ml. A partir de diluciones decimales se siembran en: caldo tripticasa a 31º durante 48 horas, de los tubos
en crecimiento se siembran en Mossel y se confirma.
Como medidas de prevención y control,
observaremos:
- Evitar
que se multipliquen en los alimentos
- Cocinar
los alimentos antes de servirlos
- Enfriarlos
rapidamente y refrigerar
- Control
en los platos preparados
"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HÁBITO"
ARISTOTELES
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