Guía Práctica del laboratorio microbiológico en agua y alimentos (Parte VI)

"Lo poco que hoy soy, lo soy en razón de todo lo que he aprendido" 

(El Autor)

GUÍA PRACTICA del LABORATORIO MICROBIOLOGICO 

en AGUA y ALIMENTOS (Parte VI)

j. ÁCIDOS ORGÁNICOS

Los ácidos orgánicos y sus ésteres se hallan muy difundidos en la naturaleza. Se encuentran con frecuencia en frutas; por ejemplo, el ácido cítrico de los frutos cítricos, el ácido benzoico en arándanos agrios y las ciruelas verdes, el ácido sorbico en la fruta del fresno. El ácido láctico se encuentra en los tejidos animales; el galato de metilo en las hojas de diversos géneros de plantas y en las especias se encuentran varios ácidos orgánicos. Muchos de ellos constituyen metabolitos intermediarios y productos finales del metabolismo microbiano y se encuentran en grandes cantidades en muchos productos lácticos, cárnicos y vegetales fermentados. Nuestros antepasados descubrieron que los cambios deseables desarrollados sobre el aroma y la textura de estos productos y la acidez provocada por la formación de ácidos orgánicos constituía un medio valioso para retrasar o evitar la alteración proteolítica. Ello permitió conservar almacenados muchos alimentos perecederos y hacer la dieta más variada. Hoy en día muchos fabricantes utilizan ciertos ácidos orgánicos para ayudar a la conservación de diversos productos. Sin embargo, la concentración y el tipo de ácidos orgánicos permitida son cuidadosamente controlados por los organismos gubernamentales responsables de la Sanidad, y las concentraciones permitidas son generalmente pequeñas, comparadas con las de los ácidos orgánicos en muchas frutas y productos fermentados.

 

Por su solubilidad, sabor y baja toxicidad los ácidos orgánicos de cadena corta, tales como el acético, benzoico, cítrico, propiónico, y sórbico son muy utilizados como conservadores o acidificantes. Al considerar la posible utilización como conservadores de otros ácidos orgánicos es conveniente recordar que la actividad antimicrobiana de estos compuestos suele ser superior a medida que se alarga la longitud de su cadena molecular. Sin embargo, los ácidos alifáticos de más de diez u once átomos de carbono poseen muy poca aplicación potencial debido a su muy baja solubilidad en agua. Los métodos de análisis de los ácidos orgánicos en los alimentos se basan generalmente en una destilación en corriente de vapor, o por solventes, seguido de una valoración del tipo y proporción del ácido (o ácidos) en cuestión presentes en el destilado mediante espectrofotometría o cromatografía. Los detalles de los métodos pueden hallarse en la mayor parte de los libros de texto o tratados de análisis químico, como por ejemplo los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC. La actividad antimicrobiana de un ácido orgánico o su éster se debe a las moléculas no disociadas de este compuesto. Algunos ácidos orgánicos en su estado no disociado son muy solubles en las membranas celulares. Únicamente los ácidos orgánicos lipófilos muestran actividad antimicrobiana. Según una hipótesis, estos compuestos inhiben el crecimiento de los microorganismos, o los matan, por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento en el transporte de sustratos y en la fosforilización oxidativa del sistema transportador de electrones. Los ácidos orgánicos saturados, como el ácido sórbico y los ésteres del ácido parahidroxihenzoico, también inhiben el sistema de transporte de electrones. 

Este fenómeno da lugar a la acidificación del contenido celular, que es probablemente la principal causa de la inhibición y muerte de los microorganismos. El pKa (pKa = al pH en el cual el 50 % del ácido se halla no disociado) de los ácidos orgánicos empleados como conservadores se halla en el rango de pH de 3,5. Al bajar el pH de un alimento, aumenta la proporción de las moléculas no disociadas de un determinado ácido orgánico, aumentando de esta forma su efectividad como agente antimicrobiano. Estas consideraciones limitan la utilidad de los ácidos orgánicos a aquellos alimentos de pH inferior a 5.5. Los ácidos orgánicos se utilizan principalmente como agentes micostáticos.  Sin embargo, a concentraciones elevadas, resultan muy eficaces frente a diversos microorganismos (incluidos los virus): por ejemplo, cuando sus concentraciones son superiores al 1% en frutas y productos fermentados con microorganismos, o cuando se acidifica hasta pHs de 4,0 o valores inferiores. Los efectos observados en cultivos mixtos o en alimentos almacenados en los que un microorganismo ejerce un efecto sinérgico o antagónico sobre otro, se cree que, en muchos casos, se debe a la formación "in situ" de ácidos orgánicos como productos secundarios del crecimiento microbiano.  La mayor parte de los ácidos orgánicos son muy poco eficaces como inhibidores del crecimiento microbiano a pHs de 5,5-5,8 en los que crecen la totalidad de las bacterias causantes de toxinfecciones y la mayor parte de las causantes de alteración. Constituyen una excepción los ésteres del ácido paraludroxibenzoico, con un pKa = 8,5, que muestran actividad antimicrobiana a pHs próximos a la neutralidad, y los ácidos propiónico y sórbico que también poseen cierta actividad a pH = 6,0 ó 6,5. 

Existen muchas publicaciones en la literatura científica y muchas patentes que atribuyen un espectro amplio de actividad antimicrobiana a una gran variedad de ácidos orgánicos de cadena recta ramificada, saturados o insaturados. Un cierto número de ácidos orgánicos saturados de cadena más larga son muy eficaces como inhibidores, tanto de las bacterias Gram positivas como Gram negativas, pero la actividad frente a las gram-negativas cae rápidamente en aquellos con más de ocho átomos de carbono. La refrigeración aumenta la actividad bactericida de los ácidos nonanoicos y decanoicos frente a Escherichia coli. Los ácidos grasos no saturados de cadena larga son particularmente eficaces contra las células vegetativas de las bacterias Gram-positivas y evitan también la germinación de los esporos de las especies de Bacillus. Los cis-isomeros son más eficaces que los trans-isomeros y la actividad de un compuesto con determinado tamaño molecular aumenta con el grado de insaturación de la molécula. Por lo general, la utilización de ácidos orgánicos es compatible con la de otros conservadores o sistemas de conservación y de hecho muchas combinaciones poseen un efecto sinérgico. Por ejemplo, muestran mayor eficacia como inhibidores microbianos a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento y mayor como microbicidas a medida que la temperatura aumenta.  Algunos ejemplos de combinaciones sinérgicas son las siguientes: a) benzoato con anhidrido sulfuroso, anhidrido carbónico, cloruro sódico o sacarosa; b) propionato con anhidrido carbónico; c) sorbato con sacarosa, cloruro sódico o con nisina y polifosfato; d) ácido láctico con ácido acético; e) propionato con sorbato (contra los estafilococos); y f) ácido benzoico y bórico contra los aspergillus. 

Cuando se utilizan tales combinaciones se precisan concentraciones inferiores de cada uno de los componentes para obtener el mismo efecto protector. La eficacia de los ácidos orgánicos como agentes antimicrobianos se mejora, generalmente, por los aniones que interfieren con la disociación de la molécula de ácido. Determinados cationes pueden también aumentar de una manera significativa la eficacia de los ácidos orgánicos aumentando la solubilidad del ácido en la membrana de la célula microbiana. Algunos microorganismos parecen poseer un sistema de transporte de ácidos orgánicos desde la célula, que es inducible y funciona mediante un aporte energético, lo que permite su crecimiento en presencia de elevadas concentraciones de ácidos. La formación de peróxidos y otros productos resultantes de la oxidación de los ácidos grasos puede aumentar la eficacia antimicrobiana de ciertos ácidos grasos insaturados. Sin embargo, los ácidos orgánicos, al igual que la mayor parte de inhibidores microbianos, suelen ser más eficaces en condiciones anaeróbicas, que aeróbicas. Existen varias limitaciones al valor como inhibidores microbianos de los ácidos orgánicos en los alimentos:

1. Suelen resultar ineficaces cuando los niveles iniciales de microorganismos son elevados.

2. Muchos microorganismos utilizan los ácidos orgánicos como fuente metabolizable de productos carbonados.

3. Existe una variabilidad inherente en cuanto a la resistencia de determinadas cepas.

4. En determinadas condiciones de utilización, pueden resultar seleccionados tipos de microorganismos resistentes.

El ácido acético y sus sales son muy eficaces como acidificantes y conservadores y son muy utilizados para estos propósitos. Únicamente los Ácetobacter sp., algunas bacterias lácticas y algunos mohos y levaduras muestran cierto grado de resistencia a este compuesto. La presencia de 1-2 % de ácido acético no disociado en carne, pescado, o vegetales suele inhibir o matar todos los microorganismos presentes, aunque, en condiciones normales de utilización, especialmente en malas condiciones higiénicas, pueden sobrevivir los microorganismos más acidotolerantes. Esta concentración de ácido puede reducirse significativamente si se trata de productos refrigerados o con una elevada concentración de sal o azúcar. El crecimiento de la mayor parte de las bacterias causantes de toxiinfecciones y de las esporulantes, se inhibe con concentraciones de 0,1 %, y el de los mohos micotoxigénicosa concentraciones de 0,3 %. El ácido benzoico se usa esencialmente como agente micostático. Muchas levaduras y mohos se inhiben a concentraciones de 0,05 – 0,1% de ácido no disociado. Las bacterias esporulantes y causantes de toxiinfecciones se inhiben generalmente con concentraciones de 0,01-0,02 % pero la mayor parte de las bacterias causantes de alteraciones son mucho más resistentes y no debe, por tanto, confiarse en el ácido benzoico para la conservación de los alimentos capaces de permitir el crecimiento bacteriano. Los ácidos cítrico y láctico, tienen por lo general, solamente una actividad antimicrobiana moderada y excepto a bajos valores de pH, no resultan eficaces como inhibidores. Sin embargo, una concentración de ácido cítrico no disociado de 0,001 % inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus en condiciones anaeróbicas. Tanto el ácido cítrico como el láctico parecen inhibir específicamente la formación de aflatoxinas y sterigmatocystina.

k.  ANTIBIÓTICOS Y ALIMENTOS

Los antibióticos, producidos por microorganismos o sintéticamente, inhiben a los microorganismos a grandes diluciones. Los microorganismos de los alimentos pueden convertirse en antibiótico resistentes y colonizar el intestino del hombre y de los animales; sus residuos pueden asimismo ejercer una acción selectiva favoreciendo a la flora resistente ya existente en el intestino; en estas condiciones los antibióticos empleados terapéuticamente pueden resultar ineficaces. Una de las más importantes razones de la persistencia de bacterias resistentes es el empleo indiscriminado de medicamentos antimicrobianos en el hombre y en el ganado (WHO, 1976). Los microorganismos antibiótico resistentes carecen de interés en los alimentos procesados térmicamente, debido a que, en general, hay que esperar que se destruyan durante el tratamiento; sin embargo, pueden encontrarse en los alimentos crudos y llevar a cabo la contaminación de otros alimentos.  Como consecuencia del gran éxito terapéutico de los antibióticos en las enfermedades bacterianas, era natural que se ensayasen como conservadores frente al deterioro microbiano de los alimentos. Estos ensayos se realizaron entre 1945 y 1960 y la mayoría de los antibióticos se comprobaron en múltiples alimentos perecederos de todas las formas imaginables.  A medida que fue aumentando el miedo a los microorganismos antibióticoresistentes fue disminuyendo el empleo de los antibióticos como conservadores de los alimentos.  Los dos antibióticos más importantes empleados en muchos países con fines conservadores alimenticios son la natamicina y la nisina, ninguno de los cuales se utiliza en terapéutica. La tilosina (un antibiótico macrólido), entre los antibióticos poco resistentes se emplea todavía como aditivo de los piensos. 

Este antibiótico ocupa una posición intermedia ya que se utiliza algo, principalmente en Japón, como conservador alimenticio. Su empleo al parecer, ha sido abandonado. La natamicina es un antibiótico macrólido originado por Streptomyces natalensis; su principal efecto es antifungico y su empleo está permitido en ciertos países. In vitro inhibe el desarrollo de hongos productores de aflatoxinas en los cacahuetes crudos triturados. Ello constituye una ventaja considerable, lo que para algunos expertos seria suficiente para superar cualquier objeción acerca del empleo de este antibiótico en los alimentos. Hay varias publicaciones sobre el empleo de la natamicina para inhibir el desarrollo fúngico de los embutidos. Por ejemplo, con concentraciones de natamicina de unas 1000 ppm se conservaron bien, sin sufrir ataques fúngicos, embutidos holandeses. El antibiótico puede aplicarse con salmuera, baños o en forma de "spray" y el embutido puede incluirse en diferentes tipos de tripas. Este tratamiento determinó una concentración superficial de 2 ppm/cm² que se consideró que no tenía importancia toxicológica. Probablemente la aplicación más importante de la natamicina es para tratar la corteza del queso, tanto blando como duro, mediante la sumersión de aquél en baños, o rociándolo con suspensiones de 500 ppm de natamicina. El antibiótico puede detectarse en la corteza; su penetración varía de acuerdo con el tipo de queso. También se ha empleado la natamicina en las películas de envolver queso; su efecto conservador se pierde si se aplica después de desarrollado el micelio. Ciertos mohos, (A. flavus) producen enzimas en cantidad que inactivan la natamicina. 

Los antibióticos macrolidos contienen un anillo grande de lactona, pocos dobles enlaces, ningún atomo de nitrógeno y en el anillo uno o más restos azucarados.).  La nisina es un antibiótico originado por estirpes de la bacteria que normalmente corta la leche, el Streptococcus lactis; se presenta naturalmente en la leche ácida y en el queso de granja por lo que es muy posible que desde que se domesticaron las vacas se hayan ingerido pequeñas cantidades de este antibiótico. El empleo de la nisina como conservador alimentario se ha estudiado con profundidad y se ha revisado la mayoría de la bibliografía sobre el tema, no se emplea ni en los piensos, ni en medicina humana o veterinaria; los microorganismos que desarrollan resistencia frente a este antibiótico se ignora si son resistentes a otros. La nisina es un polipéptido que lo inactivan fácilmente los enzimas proteolíticos a pH = 8, por lo que es fácilmente digerido; estudios extensos realizados con ratas a las que se suministró per os durante dos años hasta 8 mg/kg de peso no manifestaron toxicidad alguna. El empleo de la nisina como conservador de alimentos "debería considerarse aceptable siendo la ingesta media diaria incondicional de 0 – 33.000 U/Kg de peso" (WHO, 1969). (Hay unos 40.000.000 de unidades por g de nisina pura; para la conservación de alimentos se recomiendan de 100 a 400 unidades por gramo de alimento (ó 2,5 – 10 ppm). Actualmente se elabora nisina en la URSS, Polonia y Reino Unido y su empleo está permitido en unos 20 países. La nisina posee un pequeño espectro antibacteriano afectando sólo a los gérmenes gram positivos. Puesto que las bacterias gram negativas no son afectadas el empleo de la nisina como conservador de alimentos no puede contrarresar a una mala higiene; su escaso espectro antibacteriano y su estabilidad ácida determinan unas condiciones de aplicación especiales. Sólo puede emplearse eficientemente cuando los microorganismos alterantes nisina sensibles son prácticamente los únicos presentes en el alimento. Este es el caso por ejemplo, de los clostridios que originan hinchamiento en el queso suizo. 

No obstante y por otras razones, este proceso apenas se utiliza en la práctica; el antibiótico es también termoestable especialmente en condiciones de acidez; de aquí que la nisina se pueda emplear como adyuvante del tratamiento térmico. El calor aplicado puede reducirse a sólo el necesario para destruir Clostridium botulinum que es el anaerobio esporulado más nisin-resistente. Este menor tratamiento térmico mejora la calidad del producto alimenticio; además estos productos presentan mejores condiciones de almacenamiento, especialmente a temperaturas ambientales altas. En el proceso combinado calor-nisina, esta evita el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico. Sin embargo a las concentraciones corrientemente utilizadas, 100 U/g, la nisina no parece que sea esporicida; por lo tanto, el proceso debe planificarse de forma que quede suficiente cantidad de nisina después del tratamiento térmico y durante el almacenamiento para asegurar la continúa inhibición del crecimiento de las esporas. Cuando la legislación lo permite la nisina no sólo se emplea para prevenir el abombamiento de los botes sino también para conservar el queso procesado y el chocolate con leche. Otras industrias alimenticias la emplean para conservar guisantes, alubias en salsa y capsuts. 

El suministro de antibióticos ha permitido también el desarrollo de unas condiciones de cría intensivas y superpobladas que caracterizan a las modernas técnicas de explotación animal.  Pronto se puso de manifiesto la preocupación por el desarrollo de resistencia de la microflora de los animales a los que se suministraban antibióticos. La ganancia en peso vivo atribuible a los bajos niveles de antibióticos suministrados con el pienso durante periodos grandes de tiempo no ha variado. No obstante, el aumento de la incidencia de microorganismos antibiótico-resistentes ha causado preocupación. La existencia de microbios resistentes se conoce desde el trabajo pionero de Paul Erlich a comienzos de siglo; pensó que estas bacterias se convertían en resistentes por una mutación cromosómica espontánea o por la selección, en presencia del agente químico terapéutico, de las bacterias resistentes ya existentes en la población microbiana. La resistencia de tipo cromosómico es específica de un grupo de antibióticos relacionados entre sí. Un nuevo desarrollo en la historia de la resistencia bacteriana fue el descubrimiento de los investigadores japoneses de resistencia múltiple a fines de los años 1950; las bacterias pueden convertirse en resistentes simultáneamente a varios grupos de antibióticos no relacionados entre sí (véanse las revisiones de Watanabe, 1963 y Falkow, 1975). La resistencia múltiple se adquiere por transferencia desde un microorganismo resistente a otro sensible, de un elemento genético, llamado plásmido; existe independientemente del cromosoma bacteriano y en un mismo microorganismo puede haber uno o varios tipos diferentes de plásmidos. El relacionado con la antibiótico – resistencia microbiana se ha llamado también factor de resistencia (factor R) y la bacteria que lo posee suele denominarse R⁺. 

Los plásmidos, como los cromosomas, se componen de moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA); los plásmidos R más grandes representan el 1 – 2 % de la información genética total de las bacterias. La transferencia puede tener lugar entre miembros de especies distintas; por ello los factores R son especialmente importantes en las enterobacterias en las que existe la posibilidad de que se transfiera antibiótico resistencia de un Escherichia coli no patógeno a una Salmonella patógena. Todos los géneros de enterobacterias pueden contener factores R. También poseen plásmidos de resistencia las pseudomonas y los estafilococos y estreptococos. Es posible que tal transferencia de factores R ocurra en condiciones naturales entre las bacterias que pertenecen a la misma familia. Se admite ahora generalmente que la mayoría de las "resistencias" de las bacterias de tipo salvaje se deben a factores R y no son del tipo cromosómico.  El concepto que de ello emerge es el de un sistema ecológico común al hombre y animales. Los problemas de transferencia de factores R de las bacterias patógenas a las inocuas y el consiguiente miedo a que falle la terapéutica antibiótica humana, especialmente en el caso de resistencia antibiótica múltiple ha llevado al establecimiento de comisiones de encuesta. Quizá las más importantes sean el Comité Swabb del Reino Unido y la Task Force de la Administración de Alimentos y Medicamentos (departamento de Salud, Educación y Bienestar de los EEUU. FDA., US. Department offlealth, Education and Welfare). En general ambas comisiones estudian el problema bajo los mismos puntos de vista, pero las recomendaciones y la legislación de ambos países difieren apreciablemente. 

Ni el comité Swann, ni la Task Force encontraron pruebas que demostrasen que los residuos de antibióticos de los productos originados por animales que habían recibido con el pienso cantidades subterapéuticas de antibióticos fuesen tóxicos para el consumidor. Además tampoco pudieron comprobar que tales productos contribuyesen a las reacciones alérgicas de personas que se hubieran sensibilizado previamente a los mismos.  De otra parte ambas comisiones se mostraron preocupadas porque las formas antibiótico-resistentes de las bacterias patógenas del hombre pudieran presentarse en los animales y de éstos pasar a la especie humana. Un informe de la OMS (World Health Organization, 1973) hace énfasis en que los beneficios del suministro de concentraciones bajas de antibióticos son demasiado grandes como para considerar su retirada del empleo ganadero.  No obstante, dado que los antibióticos son indispensables para la terapéutica humana y animal, el citado informe los ha ordenado de acuerdo con su mayor peligro. Aquellos que presentan menos peligro son adecuados para su utilización con el pienso, mientras los que presentan gran riesgo no son aptos para este fin. 

A continuación se clasifican los antibióticos empleados con fines terapéuticos, profilácticos o alimenticios en orden creciente de peligrosidad respecto al desarrollo de resistencia bacteriana:

1. Bacitracina, flavofosfolipol (Este es el nombre no registrado de un antibiótico cuya denominación comercial registrada es la de flavomicina), virgmiamicina.

2. Polimixina, furanos, lincomicina, tilosina y macrólidos relacionados con ellos.

3. Eritromicina, espiramicina, oleandomicina.

4. Penicilina, tetraciclinas.

5. Ampicilina, cefalosporinas.

6. Sulfonamidas, estreptomicina, neomicina.

7. Cloranfenicol.

La Comunidad Económica Europea (CEE) reconoció en la década de 1960 el riesgo de suministrar antibióticos que pudieran seleccionar los microorganismos resistentes que albergan plásmidos y desaconsejó el empleo como aditivos del pienso de tetraciclinas, estreptomicina y antibióticos relacionados con ellas. Se prohibió el empleo de la penicilina por el amplio uso que se hace de este antibiótico en medicina humana y animal. En la CEE nunca se han utilizado con fines nutritivos el cloranfenicol, polimixina, ampicilina, cefalosporinas, ni sulfamidas; sin embargo, algunas de éstas siguen utilizándose como coccidiostático en avicultura. Continúan los comentarios sobre si el empleo de los macrólidos, incluida la lincomicina, debería prohibirse en terapéutica animal y en los piensos; algunos antibióticos pueden excluirse de su empleo animal. 

l.  ENVASES Y ENVASADO DE LOS ALIMENTOS

El envasado preserva la calidad de los alimentos y los protege de los daños que pudieran producirse durante el almacenamiento, el transporte y la distribución. La protección ejercida puede ser de tres tipos:

1. Química. El envasado puede impedir el paso del vapor de agua, del oxígeno y de otros gases, o actuar de forma selectiva, permitiendo sólo el paso de algunos de los gases.

2. Física. El envasado puede proteger de la luz, el polvo y la suciedad, de las pérdidas de peso y de los daños mecánicos.

3. Biológica. El envasado puede impedir el acceso al alimento de microorganismos e insectos, afectar el modo o velocidad de la alteración, o la supervivencia y crecimiento de los gérmenes patógenos que pudiera haber en el alimento.

Los envases pueden ser rígidos (latas, papel, cartón, vidrio, plástico) o flexibles (plásticos, hoja de aluminio). Los plásticos son cada vez más utilizados. Mediante diversas combinaciones de materiales y técnicas de procesado, es posible producir envases con cualquiera de las propiedades funcionales que se consideren deseables. Los componentes e impurezas de los materiales de envasado y sus adhesivos, no deben poner en peligro la salud humana ni reaccionar con el alimento o adulterarlo. El material de envasado no debe contener microorganismos patógenos que puedan introducir un riesgo para el consumidor. Por ejemplo, la presencia de salmonellas en un material de envasado que vaya a usarse para un plato precocinado y congelado, sería inaceptable.  Sin embargo, no habría razón para preocuparse excesivamente por la presencia de unos cuantos esporos de Clotridium perfringens en el material utilizado para envasar especias deshidratadas, porque de cualquier manera, es fácil que existan esos mismos esporos en la misma especie. Tampoco debe el material de envasado introducir cantidades importantes de microorganismos causantes de alteración.  

Se ha desarrollado un procedimiento que mediante un sencillo chorro de vapor, sirve para descontaminar los recipientes empleados para cocer jamones. Muchos países imponen standards microbiológicos para controlar la contaminación superficial de botellas y otros recipientes reutilizables; una contaminación superficial de sólo 10 microorganismos por 100 cm² equivale a "muy limpio". En papel sin tratar, se ha podido observar que predomina el género Bacillus y a veces los micrococos, a niveles normalmente inferiores a los 200/gramos, aunque a veces se llega hasta 2800/g; en otro estudio similar, se encontraron mohos y levaduras a niveles de hasta 10 por 100 cm². En Estados Unidos, el papel para envasado de alimentos no debe sobrepasar los 250 organismos por gramo y los recipientes y tapas para leche, no más de uno por cm². Se ha propuesto un método standard para la determinación del recuento de bacterias, mohos, levaduras y gérmenes coliformes en materiales de envasado no absorbentes. Los niveles de bacterias en la superficie de hojas de aluminio utilizadas para el envasado de alimentos, son aún menores. Los tubos y películas de plástico suelen tener entre 1 y 20 microorganismos por cada 1000 cm² y normalmente no llegan a los 10. En los vasitos de plástico, los valores encontrados son del mismo orden. Sin embargo, algunos microorganismos sobreviven incluso a la extrusión a 220ºC de los plásticos. A veces, se presta demasiada importancia a la contaminación microbiana aportada por el material de envasado; en general, los niveles de microorganismos contenidos en el producto son varios órdenes de magnitud mayores de los que existen en el material de envasado. Al no poder ser degradados por la acción microbiana, el poliestireno y otros plásticos, son más higiénicos que el papel prensado u otros derivados de la madera para el envasado de huevos (Pfeiffer,1972), carne (Bólime, 1971) o frutos en baya (Ayres y Denisen, 1958). Algunos plásticos tienen propiedades antibacterianas; es el caso de los que contienen alquido-barnices, resinas fenólicas, cloruro de polivinilo o poliacetal (Gundermann y Glück, 1971). Sin embargo, antes de escoger un material de envasado por sus propiedades antimicrobianas, conviene asegurarse de que no va a adulterar el alimento. 

El material de envasado debe impedir la entrada de los microorganismos; las botellas, latas y la mayoría de las películas de plástico actualmente en el mercado, cumplen esta función.  Se produce penetración cuando falla el sellado o se perfora el envase; por eso, el material ha de tener la suficiente resistencia mecánica como para impedir que se produzcan daños durante el procesado y la manipulación posterior. El mismo contenido puede también dañar el envase: es el caso de los huesos afilados de aves y otras carnes, y de las fibras de músculo o trozos de piel en alimentos muy desecados o ahumados. Una prueba biológica es lo mejor de determinar si una película resistirá a la penetración; se sumerge una porción estéril de un medio nutritivo empaquetada con el material en cuestión y sellada, en un baño que contenga el microorganismo concreto que interese (por ejemplo, Enterobacter) o una mezcla de microorganismos. La presencia de gas o la turbidez en el medio indicará que se ha producido penetración. Para el ensayo de laminados de plástico y aluminio resistentes al calor, se ha recomendado la "prueba de ebullición en agar", en la que los envases se hierven durante 45 minutos en agar al 2 %. Antes de que se enfríe el agar, se añaden esporos de Bacillus stearothermophilus y durante el enfriado, el medio inoculado pasa a través de los puntos de penetración.  Varios autores han demostrado que algunos microorganismos pueden atacar los materiales de envasado sintéticos y, en condiciones favorables, pueden atravesar una película no dañada previamente. En algunos casos, se requiere una exposición prolongada a los enzimas bacterianos para que sea posible la entrada. 

Por ejemplo, los microorganismos productores de celulasa, sobre todo los mohos, no atraviesan las tripas de hidrato de celulosa de los embutidos, más que al cabo de mucho tiempo a temperaturas relativamente altas. Las películas de plástico tienen muy variada permeabilidad a los gases. La exclusión del oxígeno disminuye la velocidad de oxidación del producto, hace más lento el crecimiento de muchos tipos de bacterias y levaduras e impide el crecimiento de los microorganismos aerobios estrictos (como los mohos, por ejemplo). La alta permeabilidad al oxígeno del poliestireno y las poliolefinas, puede ser reducida combinando estos polímeros con otros materiales mediante barnizado, encolado, recubrimiento o superposición con una capa del otro material o por coextrusión de ambos materiales. de forma análoga, se puede reducir la permeabilidad al vapor de agua de un material; la alta permeabilidad del hidrato de celulosa, por ejemplo, puede reducirse mediante barnizado. El factor más importante de la microbiología de los alimentos envasados es la permeabilidad relativa del material de envasado para el oxígeno, el dióxido de carbono y el vapor de agua, particularmente si los espacios con aire en el producto original han sido evacuados o rellenados con gases preservantes en el momento de cerrar el envase, y sobre todo, si se trata de productos perecederos, tales como aves, carnes y pescados.  Los envoltorios permeables al vapor de agua y a los gases, o más permeables al oxígeno que al dióxido de carbono y aquellos que no se ajustan a la superficie del producto, pueden evitar la entrada de microorganismos contaminantes, pero no afectan al crecimiento de los microorganismos que previamente se encontraban en el alimento. Las condiciones intrínsecas de un alimento envuelto en un material muy permeable, son similares a las del producto sin envolver. Por ejemplo, las películas de celulosa permeables al oxígeno no impiden que crezcan las Pseudomonas en la carne picada, mientras que las películas impermeables a los gases lo hacen imposible. Las películas de materiales que como el polietileno, son impermeables a la humedad y permeables al oxígeno, sirven para proteger de la contaminación y de las pérdidas de agua, pero más que frenar, estimulan el crecimiento en superficie de la flora normalmente causante de alteración. El crecimiento y la actividad de los microorganismos dentro de un envase depende de: a) la idoneidad del alimento como medio de cultivo, b) la temperatura, c) la aw, d) el pH, e) la naturaleza de los gases retenidos dentro del envase y f) la competencia entre microorganismos. 

ll.  LOS GASES COMO CONSERVADORES

Desde hace muchos años se sabe que diversos gases y vapores naturales, o artificialmente producidos, destruyen o inhiben a los microorganismos. Algunos de ellos se han estudiado para conocer su capacidad potencial de aumentar la vida útil de los alimentos. De estos, sólo se discutirán con detalle los que se han utilizado comercialmente: dióxido de carbono, óxido de etileno, óxido de propileno, dióxido de azufre y ozono. El nitrógeno y el oxígeno se utilizan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de alimentos pero su fin primario no es la inhibición de los microorganismos. El nitrógeno líquido, cuando se utiliza en los alimentos como un agente frigorífico, inhibe o destruye indirectamente a los microorganismos por congelación o refrigeración. El oxígeno se utiliza en atmósferas controladas para mantener el estado fisiológico de las frutas, hortalizas y verduras y el característico color rojo de la carne fresca pero no se aplica con el fin de inhibir los microorganismos responsables de la alteración. Diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con éxito en la desinfección de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo pero no se han aplicado a los alimentos. Entre ellos están la ß – propiolactona, la clorpicrina, el glicolaldehído, el glutaraldehido y el ácido peracético. Aunque el bromuro de metilo se ha utilizado eficazmente, como fumigante, en las frutas y granos infestados por insectos, no se ha empleado específicamente para controlar los microorganismos en los alimentos. El formaldehído se ha utilizado como fumigante en la desinfección de gallineros y huevos para incubadoras pero igualmente no directamente para el control de los microorganismos en los alimentos. 

El formaldehído realmente ejerce una acción letal sobre los microorganismos de la carne y del pescado durante el ahumado pero como el calor y la desecación están también implicados en el proceso, su contribución real a la inhibición de los microorganismos es desconocida. Investigaciones recientes han mostrado que el monóxido de carbono y el acetaldehído son potencialmente útiles para su uso en los alimentos. Un uno por ciento de monóxido de carbono prolonga el color de la carne fresca y tiene un efecto inhibidor sobre las bacterias psicrotrofas, similar al del dióxido de carbono. Los vapores de acetaldehído al 0,5 % en la atmósfera inhiben, de una forma acusada, los mohos y levaduras aumentando el tiempo de conservación de las frutas, hortalizas y verduras. El dióxido de carbono, gas a las temperaturas normales de almacenamiento, es incoloro, inodoro e incombustible. No es tóxico para el hombre a concentraciones inferiores a un 10 % pero por encima de este nivel una exposición prolongada a la acción del mismo da lugar a la pérdida del sentido, lo que es importante tener en cuenta cuando se utilice a altas concentraciones en los grandes almacenes y vehículos de transporte. No deja residuos tóxicos ni su aplicación presenta serios problemas mecánicos. El gas se comercializa habitualmente, en forma líquida, en bombonas de acero a una presión de 58 Kg/cm² (830 lb/pulgada²) aproximadamente o en forma sólida como nieve carbónica. A presión atmosférica, la forma sólida se transforma en gas sin pasar por el estado líquido, sublimándose a -78,5ºC a la presión normal. Para la manipulación de la nieve carbónica deben utilizarse guantes ya que el contacto momentáneo con la piel a -78,5ºC puede causar quemaduras por congelación y ampollas. 

El dióxido de carbono se disuelve bien en agua (1,71 ml CO2/ml H2O a 760 mm de presión y a 0ºC) y, por tanto, en los zumos de frutas pero la absorción parece ser un fenómeno totalmente físico que implica una unión no más intensa que la del ácido carbónico. Cuando se absorbe en los alimentos, el pH baja de acuerdo con la cantidad de ácido carbónico que se forma y con la capacidad tampón del alimento pero de nuevo aumenta cuando el CO2 se elimina por exposición al aire o por un calentamiento suave del producto. El dióxido de carbono destruye, estimula, inhibe o no tiene efecto alguno de resaltar sobre los microorganismos, dependiendo de los microorganismos, de la concentración de dióxido de carbono, de la temperatura de incubación, de la edad de las células microbianas en el momento de aplicar el CO2 y de la actividad de agua del alimento o medio de cultivo. De todos estos efectos, los de mayor importancia en relación con el procesado y conservación de los alimentos son, sin duda, los destructivos e inhibidores. Existe una considerable variación en lo referente a la sensibilidad al CO2 a nivel de género, especie y cepa. Por ejemplo, el CO2 al 100 % destruye totalmente, tras una exposición de 4 días a temperatura ambiente, a algunos cultivos de Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium y Micrococcus mientras el efecto es nulo o escaso sobre Proteus spp., Clostridium perfringens y algunos tipos de Lactobacillus. 

Por tanto, aunque la acción del CO2 sobre los microorganismos es selectiva, la mayoría de las levaduras, mohos y algunas bacterias son inhibidos por concentraciones comprendidas entre 5 y 50 % (viven la fase gaseosa) pero no son destruidos o inhibidos totalmente. Concentraciones inferiores a aquellas no tienen efecto alguno o realmente estimulan el crecimiento. La inhibición aumenta de una forma casi lineal cuando se incrementa la concentración de CO2 desde un 5 % hasta el 25 - 50 %, dependiendo siempre del alimento y de la flora implicada. A concentraciones superiores a ésta el incremento de la inhibición es escaso o nulo. Aunque el grado de inhibición varía con los microorganismos y el alimento, con un 10 % se logra habitualmente una inhibición del orden del 50 % sobre la base del recuento total después de un determinado tiempo de incubación. El efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos en los alimentos parece mayor a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento según se deduce del aumento relativo de la vida útil del alimento al descender la temperatura de almacenamiento. Sin embargo, cuando los efectos de la temperatura y del CO2 se estudian por separado, se observa que la acción del CO2 se incrementa al aumentar la temperatura. El efecto inhibidor del CO2 se manifiesta, tanto en las bacterias como en los hongos, por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generación durante la fase logarítmica. No obstante, a concentraciones comprendidas entre el 5 y el 20 %, el efecto mayor se logra en la fase de latencia. La aplicación de gas una vez que las células microbianas ha empezado a adaptarse al medio, o cuando ya están en la fase logarítmica, el efecto del CO2 se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en estudios realizados con cepas psicrotrofas del género Pseudomonas y del grupo Acinetobacter – Moraxella se comprobó que si se retrasa la aplicación del CO2 (20 %) hasta 1 ó 2 días después de la inoculación sobre la superficie de la carne, el efecto inhibidor es menor. Sin embargo, si la concentración de CO2 era del 40 % el momento en que se expone el producto a la atmósfera de CO2 tiene una influencia menor. 

La velocidad de crecimiento en atmósfera de CO2 no aumenta con el tiempo, es decir, la inclinación de la curva de crecimiento no cambia. Esto indica que el sistema metabólico no se adapta durante la fase de exposición al CO2 ni existe, en este caso, una selección de los microorganismos CO2 -resistentes. La reducción de la actividad de agua del medio aumenta el efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos. El mecanismo de inhibición de los microorganismos por el CO2 no se conoce todavía con claridad. Sin embargo, ya en 1889 se observó que se debía a la presencia real de dióxido de carbono y no a la ausencia de oxígeno y que el efecto es reversible, ya que los microorganismos tratados recuperan la velocidad de crecimiento normal cuando se dejan de exponer a la atmósfera de CO2. No obstante, en el caso de los microorganismos que alteran la carne, permanecen efectos inhibidores residuales cuando el gas se ha dejado de aplicar. El efecto directo del gas sobre las células microbianas se confirmó muchos años más tarde en experimentos realizados con Pseudomonas aeruginosa. El descenso del pH debido a la formación de ácido carbónico en el medio tiene un efecto perjudicial sobre ciertos microorganismos; por ejemplo, una atmósfera de CO2 al 20 % puede hacer bajar el pH, si el medio no está tamponado, en un valor de hasta una unidad de pH de 6,9 a 5,8.  Sin embargo, los experimentos con medios tamponados y con alimentos intrínsecamente tamponados como la carne han mostrado que el pH externo a la célula microbiana no explica totalmente el efecto adverso del CO2.

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ARISTOTELES

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