Microbiología de los alimentos (Parte 13)

"El día que perdamos la humildad, habremos puesto el primer ladrillo para construir el edificio de nuestro fracaso"

(Mahatma Gandhi)

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

(Parte 13)

Técnicas de Laboratorio y marchas clásicas

a. AGUA

El agua es un componente de nuestra naturaleza que ha estado presente en la Tierra desde hace más de 3.000 millones de años, ocupando tres cuartas partes de la superficie del planeta. Su naturaleza se compone de tres átomos, dos de hidrógeno y uno de oxígeno, y que unidos entre sí forman una molécula de agua (H₂O), la unidad mínima en que ésta se puede encontrar. La forma en que estas moléculas se unen entre sí determinará la forma en que encontramos el agua en nuestro entorno; como líquidos, en lluvias, ríos, océanos, como sólidos en témpanos y nieves o como gas en las nubes. El agua es una sustancia muy sencilla, pero posee un conjunto de propiedades que la hacen única lo que, unido a su abundancia, le otorgan una gran importancia en el ciclo biológico del planeta.

Entre sus notables propiedades se encuentran:

1) La estructura molecular del agua es un dipolo: su constante dieléctrica es muy alta, mayor que para cualquier otro líquido, lo que le confiere la propiedad de disolver cualquier sustancia . El agua puede encontrarse en la naturaleza en sus tres estados, sólido, líquido y vapor, pudiendo existir en un momento dado en equilibrio entre sus tres formas.

2) El hielo tiene una densidad inferior a la del agua líquida, (0,92 veces) y flota, lo que tiene gran importancia para la vida en mares, lagos, etc.

3) El calor específico del agua es muy alto (1 cal/gr.ºC).

4) El calor latente de vaporización del agua es muy grande: a 20º C hay que comunicar 585 cal. para evaporar un gramo de agua.

5) La conductividad térmica del agua es la mayor de todos los líquidos, con la única excepción del mercurio.

6) El agua es débilmente ionizable, conteniendo siempre algunos iones hidrógeno, dando un pH próximo a 6. La concentración de iones en el agua es muy importante para los organismos.

Veremos a continuación un esquema que ejemplifica de manera sencilla el complejo ciclo del agua en la naturaleza:

La calidad del agua, es un estado de ésta, caracterizado por su composición físico – química y biológica. Este estado deberá permitir su empleo sin causar daño, para lo cual deberá reunir dos características:

1. Estar exenta de sustancias y microorganismos que sean peligrosos para los consumidores.

2. Estar exenta de sustancias que le comuniquen sensaciones sensoriales desagradables para el consumo (color, turbiedad, olor, sabor).

El criterio de potabilidad del agua depende fundamentalmente del uso al que se la destina (humano, industrial, agrícola, etc). Agua potable es el agua, ya sea de superficie o subterránea, tratada y el agua no tratada por no estar contaminada. La definición de agua potable se ha ido adaptando al avance del conocimiento científico y a las nuevas técnicas, en especial a las relacionadas con el análisis de contaminantes.  La mala calidad del agua afecta a infinidad de actividades vitales, es un bien tan preciado que en la exposición de la Carta Europea del Agua comienza con “Sin agua no hay comida, no hay bebida, ni luz, ni calor, ni lluvia. ¡Sin agua no hay vida posible!” 

Hasta hace unas decenas de años la calidad de un agua destinada a un abastecimiento se centraba principalmente en que el agua estuviera exenta de sabores, olores, no fuera muy dura y no contuviera bacterias patógenas, confiandose en gran medida en que el poder autodepurador de los embalses o ríos, y la protección de las zonas de captación eran suficientes para lograr una aceptable calidad que se completaría con un tratamiento simple de decantación, filtración y desinfección, así como hacer determinadas comprobaciones generalmente bacteriológicas del agua en la red, ausencias de sabores y olores y presencia de ligeras concentraciones del desinfectante empleado. Hoy día y más aún de cara al futuro, y como consecuencia de la polución creciente y los mayores avances de la técnica y la ciencia hay que considerar además otros caracteres que inciden de forma perjudicial en la salud del consumidor (pesticidas, detergentes, subproductos de la desinfección y otras sustancias orgánicas e inorgánicas así como protozoos, virus, bacterias). El análisis del agua en su origen, nos proporciona los primeros datos respecto a su calidad, orientándonos en la selección de su captación y facilitando el tratamiento que hemos de aplicarle posteriormente. Un agua potable destinada al consumo humano, debe cumplir ante todo con una calidad sanitaria apta, tanto inmediatamente después de su proceso de tratamiento, como presentar una estabilidad biológica en la red de distribución. 

Definición de “AGUA POTABLE”, según el Código Alimentario Argentino Actualizado - Artículo 982 - (Res MSyAS N° 494 del 7.07.94)

Con las denominaciones de Agua potable de suministro público y Agua potable de uso domiciliario, se entiende la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud. Deberá presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente. 

A nivel mundial, el 80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales y una tercera parte de las defunciones causadas por éstas se deben al uso y consumo de agua insalubre. La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en países en desarrollo. El agua y los alimentos contaminados se consideran como los principales vehículos involucrados en la transmisión de bacterias, virus o parásitos. Los organismos transmitidos por el agua habitualmente crecen en el tracto intestinal y abandonan el cuerpo por las heces. Dado que se puede producir la contaminación fecal del agua (si ésta no se trata adecuadamente) al consumirla, el organismo patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador. Como el agua se ingiere en grandes cantidades, puede ser infecciosa aun cuando contenga un pequeño número de organismos patógenos. 

Los microorganismos patógenos que prosperan en los ambientes acuáticos pueden provocar cólera, fiebre tifoidea, disenterías, poliomelitis, hepatitis y salmonelosis, entre otras enfermedades. El agua y alimentos contaminados tienen una gran importancia en la transmisión de patógenos causantes del síndrome diarreico, por lo que se hace necesario tener estrategias que permitan un manejo adecuado de ella.  La OMS calcula que la morbilidad (número de casos) y mortalidad (número de muertes) derivadas de las enfermedades más graves asociadas con el agua se reduciría entre un 20 y un 80 por ciento, si se garantizara su potabilidad y adecuada canalización. El agua hace posible un medio ambiente saludable pero, paradójicamente, también puede ser el principal vehículo de transmisión de enfermedades. Las enfermedades transmitidas por el agua son enfermedades producidas por el "agua sucia" (agua que se ha contaminado con desechos humanos, animales o químicos). 

Mundialmente, la falta de servicios de evacuación sanitaria de desechos y de agua limpia para beber, cocinar y lavar es la causa de más de 12 millones de defunciones por año. Se estima que 3.000 millones de personas carecen, por ejemplo, de servicios higiénicos. Más de 1.200 millones de personas están en riesgo porque carecen de acceso a agua dulce salubre. En lugares que carecen de instalaciones de saneamiento apropiadas, las enfermedades transmitidas por el agua pueden propagarse con gran rapidez. Esto sucede cuando excrementos portadores de organismos infecciosos son arrastrados por el agua o se lixivian hasta los manantiales de agua dulce, contaminando el agua potable y los alimentos.  La magnitud de la propagación de estos organismos infecciosos en un manantial de agua dulce determinado depende de la cantidad de excremento humano y animal que éste contenga. Dado que se puede producir la contaminación fecal de los abastecimientos de agua, si el agua no se trata adecuadamente, el patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador, al consumirla. Las enfermedades diarreicas, las principales enfermedades transmitidas por el agua, prevalecen en numerosos países en los que el tratamiento de las aguas residuales es inadecuado. Los desechos humanos se evacuan en letrinas abiertas, canales y corrientes de agua, o se esparcen en las tierras de labranza. Las afecciones que se propagan por el agua se conocen como "enfermedades transmitidas por el agua". Sus agentes patógenos son biológicos, más que químicos, y los males que provocan casi siempre son contagiosos. Por lo general, los agentes patógenos pertenecen al grupo de los microorganismos, que se transmiten en la heces excretadas por individuos infectados o por ciertos animales. 

De forma que estas enfermedades se suelen contraer al ingerirlos en forma de agua o de alimentos, contaminados por esas heces (vía fecal – oral). Los patógenos humanos transmitidos por el agua incluyen muchos tipos de microorganismos tales como: bacterias, Virus, protozoos y, en ocasiones, helmintos (lombrices), todos ellos muy diferentes en tamaño, estructura y composición.  A causa de las enfermedades de origen hídrico y el interés de controlarlas, los estudios bacteriológicos del agua se han orientado, en su mayor parte, hacia sus aspectos sanitarios. Uno de los criterios, utilizado para determinar la calidad sanitaria del agua, es la clase y número de bacterias que se encuentran presentes. En general, los métodos utilizados están diseñados para detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de microorganismos indicadores más que para la determinación de patógenos. 

Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los microorganismos patógenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de números altos de otros microorganismos, o tienen una distribución irregular en el producto.  Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han hecho que se utilicen grupos de microorganismos de detección y cuantificación más fáciles y cuya presencia en cierto número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos y/o permitir la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de microorganismos se denominan “indicadores”. Éstos son organismos habitualmente asociados al tracto intestinal, cuya presencia en el agua indica que el agua ha recibido una contaminación de origen intestinal. 

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bacilos Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 37º C.  Incluye a los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiellay especies lactosa positivas de otros géneros. En la práctica, los organismos coliformes son siempre miembros del grupo de las bacterias entéricas. Estas bacterias son adecuadas como indicadores porque son habitantes comunes del tracto intestinal, tanto de las personas como de los animales de sangre caliente, donde están presentes en grandes cantidades. También interesa la determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes presentes en intestinos y materias fecales del hombre o animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto proporciona información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente. 

Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el Número Más Probable (NMP), aunque se han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de análisis, con el objetivo de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión, hasta el punto que se ha llegado a aceptar como método estándar.  Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas a partir de lactosa a 37ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos roscados de Caldo Mac Conkey que contiene lactosa, y agregando una campana de Durham o tubo de fermentación invertido, que permite recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se realiza con base en el hecho de que pueda producir gas desde lactosa, en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no (Caldo BRILA: Verde Brillante Bilis Lactosa). 

También es utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, que puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y con el que se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Las bacterias coliformes dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 h de incubación a 37ºC. La determinación de coliformes fecales se hace a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medios selectivos e incubando a 44,5ºC.  Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimático. En este caso, el grupo de coliformes totales incluye todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza un sustrato cromogénico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que rompe el sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorógeno. Este método permite llevar a cabo tanto recuentos como ensayos de ausencia/presencia. También se usa como indicador de contaminación fecal la presencia de Enterococcus faecalis. El hábitat normal de Enterococcus faecalis es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto, son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ríos, etc. La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas en cuanto a sus posibles huéspedes.  Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colífagos, que son bacteriófagos de coliformes, es decir, se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo con estudios de correlación entre números de colifagos y coliformes en agua, se podría utilizar el índice de colífagos como índice de calidad sanitaria del agua. Además, como son más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección que estos últimos. 

Las materias fecales del hombre y de los animales contienen una gran variedad de microorganismos enteropatógenos como Campylobacter, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Pasteurella, Francisella, Leptospira, Vibrio, protozoarios y varios grupos de virus.  Cuando estos microorganismos son descargados en aguas naturales, su presencia denota contaminación fecal y constituyen un riesgo de trasmisión de enfermedades para la población humana (Borrego et al., 1990).  Las bacterias enteropatógenas por lo general aparecen en cantidades bajas en aguas naturales, razón por la cual su detección en el laboratorio se logra con cierta dificultad. Por otro lado, las técnicas de cultivo para su aislamiento son complejas y laboriosas. Estas desventajas han llevado a diseñar técnicas microbiológicas para el análisis de agua basadas en la detección de otros microorganismos presentes en las materias fecales y que puedan servir de indicadores (Borrego et al., 1990). Aunque los Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Enterococos y Escherichia coli son utilizados como indicadores de contaminación fecal, su uso ha presentado algunas desventajas, ya que han sido reportados casos de enfermedades entéricas por consumo de agua en la cual no se había detectado coliformes. Además, ninguno de estos microorganismos sirven como indicadores de contaminación viral (Borrego et al., 1987). Por esto los virus de Escherichia coli conocidos como colifagos pueden ser mejores indicadores de contaminación fecal. La presencia de colifagos en heces humanas y desagües es constante y su detección es fácil y rápida (Wentsel et al., 1982; Cornax et al., 1991). Los colifagos son virus que infectan células de E. coli y han sidoaisladas fácilmente de aguas contaminadas conjuntamente con los coliformes totales y termotolerantes (Grabow et al. 1984). Además de ser indicadores de contaminación fecal son también considerados como indicadores de la presencia de enterovirus en aguas naturales y tratadas (IAWPRC, 1991). Estudios sobre aguas han sugerido el uso de los colifagos como indicadores de la eficacia del proceso de remoción microbiana en plantas de tratamiento durante la potabilización del agua (Jofre et al., 1995). Esto se debe a la capacidad de estos virus de ser más resistentes al proceso de tratamiento del agua que las bacterias indicadoras convencionales (Payment & Franco, 1993). El método de cuantificación se basa en la formación de placas de lisis. Los colífagos (bacteriófagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y la liberación de partículas virales que infectarán las células bacterianas adyacentes. 

A medida que las bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada, determinando las conocidas como “placas de lisis”. La cepa utilizada en los ensayos es una E. coli sensible a la infección por colífagos (ATCC 13706). La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en los países en desarrollo.  Los procedimientos sanitarios pueden aplicarse bien para evitar la contaminación del agua o bien para destruir el patógeno que ya se encuentre presente en ella. Los programas de depuración de agua han sido responsables de la disminución de las infecciones transmitidas por agua. La eliminación de la turbidez del agua por filtración, proporciona un significativo descenso en la carga microbiana del agua. Pero la filtración, por sí sola, tiene sólo un valor parcial, porque muchos organismos son filtrables. A diferencia del tratamiento con cloro que ha demostrado ser eficaz en la disminución de la incidencia de enfermedades transmitidas por agua. El agua puede contaminarse en la fuente de suministro, por el ingreso de contaminantes durante la distribución del agua y dentro de la vivienda, por el uso de recipientes mal protegidos o por la manipulación insalubre del agua, aún cuando la fuente se encuentre razonablemente protegida. Por ello, para ayudar a prevenir las enfermedades transmitidas por agua, deberían tomarse algunas medidas sencillas como:  Hervir el agua hasta que comience a evaporarse, desinfectar el agua colocando dos gotas de cloro por litro de agua, durante media hora, antes de su consumo y lavarse las manos después de ir al baño y antes de manipular alimentos. 

La investigación microbiológica de la potencial contaminación del Agua Potable de bebida se centraliza en tres exámenes de rutina a saber, NORMATIZADAS en el Código Alimentario Argentino Actualizado: 

1) Recuento de Aerobios Mesófilos, por siembra en profundidad.

2) Recuento de Coliformes totales y fecales por técnica del NMP.
3) Presencia de Pseudomona sp. por siembra en superficie.

Los criterios microbiológicos para los tres ensayos, serán ,los siguientes:

1) Aerobios Mesófilos a 37° por 24 horas: hasta 300 ufc/ml, en Agar para recuento en placa.

2) Coliformes: hasta 3 / 100ml según MNP a 37° C por 48 hs en Caldo Mac Conkey.
3) Pseudomona sp: Ausencia en 100 ml, en Agar Cetrimide a 37° C por 48 hs.
4) Escherichia coli: Ausencia en 100 ml, en Caldo Brila a 44° C por 48 hs, repicado en EMB de Levine y cotejado por Pruebas INViC.

Las muestras de agua para análisis bacteriológico siempre deben ser tomadas en envases esterilizados. El procedimiento para tomar las muestras de agua es el siguiente:

• Obtener un envase estéril que puede ser el utilizado para urocultivo, o en su defecto, un frasco de vidrio de boca ancha y con tapa roscada.
• Elegir el grifo de agua fría del cual se va a tomar la muestra. Quitar filtros y oxigenadores si los tuviere, así como cualquier otro adminículo, como mangueras, etc. No tomar muestras de: un grifo de agua caliente, un grifo que mezcle agua fría y agua cliente; un grifo que gotee; cualquier grifo que entregue agua suavizada, filtrada o de otra manera tratada; o de una manguera conectada a un grifo.
• Esterilizar la superficie interna del grifo con la llama de un hisopo de algodón embebido en alcohol (un encendedor de gas butano desechable también sirve). No limpiar el grifo después de esterilizarlo.
• Lavarse las manos antes de tomar la muestra.
• Dejar correr el agua a chorro abierto por 5 minutos, aproximadamente, para evacuar la tubería y hacer correr el agua fresca.
• Reduzca el caudal del agua al tamaño de un lápiz para tomar la muestra.
• Abrir el envase esterilizado con cuidado. Sostener la tapa en una mano y el envase en la otra (mantener la tapa en la mano y no tocar la superficie interior de la tapa o del envase). Llenar la botella completamente sin que se derrame el agua y no dejar que el agua pase encima de su mano al entrar en el envase.
• Tapar el envase inmediatamente después de tomada la muestra.
• Refrigerar la misma y llevar al laboratorio, en una cubeta con hielo, tan pronto como sea posible (dentro de seis horas es recomendado pero se puede tardar hasta 30 horas, refrigerando sin congelar).

1) Recuento de Aerobios Mesófilos Totales

Se obtiene la muestra tomada de un grifo previamente flameado, se llevan a un frasco estéril 10 ml de esta muestra y 0,1 de peptona y se realizan diluciones seriadas de 10^-1, 10^-2 y 10^-3 (esto en el caso de no ser agua de red domiciliaria oficial).  Se procede a realizar la siembra en profundidad: se colocan en la placa de Petri y con pipeta estéril 0,1 ml de cada dilución y luego se vierte Agar para Recuento en Placa (PCA) a 45° - 50° C. incubándose a 37° C por 24 a 48 hs. El CAA determina un criterio microbiológico de hasta 300 ufc (Unidades formadoras de colonia) x ml para agua potable y de hasta 10⁵ para aguas minerales.

2) Recuento de Coliformes

Aquí utilizamos la Técnica del Número más Probable (NMP) que es una combinación estadísticamente probada de tubos con Caldo Mac Conkey (simple y doble concentración) versus cantidades igualmente ya estimadas del agua problema a analizar. Estas combinaciones aparecen eln las Tablas de MNP y de allí obtenemos el resultado estimado de cuántos coliformes tenemos por 100 ml de agua a estudiar luego de 48 hs. de incubacion a 37° C.  Personalmente utilizo la siguiente combinación: 1 tubo con 10 ml de Caldo mac Conkey concentración doble más 10 ml de agua problema; 3 tubos con 10 ml de Caldo Mac Conkey concentración simple con 1 ml de agua problema cada uno y 1 tubo con 10 ml de Caldo Mac Conkey simple concentración, mas 0,1 ml de agua a estudiar. Toda ésta batería ex por cada muestra a analizar. Los tubos son roscados y con campana de Durham, y serán (+) los que desarrollen gas, viren el color púrpura del medio a marillo o ambas cosas. Por supuesto, luego pasamos a medios selectivos de identificación bacteriana y finalmente a las pruebas INViC, que nos darán el nompre y el apellido del coliforme presente.  

Asimismo, se siembran de cada muestra, 10 ml de agua problema en tubos roscados con capana de Durham, conteniendo 10 ml de Caldo Brila, los cuales se llevan en un Baño María a 44° C por 48 hs. Se sigue con los (+) el mismo procedimiento o marcha que con los tubos de Agar Mac Conkey. Cuando no hay formación de gas en 48 horas de incubación la prueba se considera negativa en ambas temperaturas: 37° C y 44° C. Si hubiesen tubos (+) se hará el siguiente paso:

a) De la batería del NMP, se tomará el tubo (+) que contenga más concentración de agua problema, y se sembrará en una placa de Agar Mac Conkey en estrías (en superficie), incubándola 24 hs a 37° C. Esto debe hacerse con cada batería en donde existan tubos (+), identificando correctamente cada muestra.

b) Con respecto al o a los tubos (+) de Caldo Brila, el proceso será similar a 1), pero se cambiará el medio sólido utilizado anteriormente por Agar EMB de Levine. 

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos peritricos que desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de lactosa y a veces también de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos.  Para enjuiciar la calidad de las aguas se recurre a parámetros físicos, químicos y biológicos. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos; es preciso hallar el número de gérmenes saprófitos o de coliformes y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de E. coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producción de gas y ácido.

Las bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombre y animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino. Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaerobios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a gran abundancias en medios corrientes, como caldo y agar.  Las colonias de E. Coli que desarrollan en Agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) de Levine, tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Asimismo, se deben realizar las llamadas Pruebas de Identificación Bioquímica o Pruebas IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Voges – Proskauer (V.P.) y Citrato). La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli (+ + - -), significa que produce Indol, es positivo al rojo de metilo y negativo al V.P. y al Citrato. Hay 16 combinaciones posibles de resultados prueba negativa y positiva.

Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de muestra.

Nº de tubos positivos	Índice NMP/100ml	Límite de confianza de 95 %
		Inferior	Superior
0	< 2,2	0	6
1	2,2	0,1	12,6
2	5,1	0,5	19,2
3	9,2	1,6	29,4
4	16	3,3	52,9
5	> 16	8	infinito

Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de muestra.

Nº de tubos positivos	Índice NMP/100ml	Límite de confianza de 95 %
		Inferior	Superior
0	< 1,1	0	3
1	1,1	0,03	5,9
2	2,2	0,26	8,1
3	3,6	0,69	10,6
4	5,1	1,3	13,4
5	6,9	2,1	16,8
6	9,2	3,1	21,1
7	12	4,3	27,1
8	16,1	5,9	36,8
9	23	8,1	59,5
10	> 23	13,5	Infinito

Número más probable por 100 ml. Usando un tubo de 50 ml, cinco tubos de 10 ml y cinco tubos de 1 ml

Tubos de 50 ml positivos	Tubos de 10 ml positivos	Tubo de 1 ml positivos	NMP por 100 ml
0	0	0	0
0	0	1	1
0	0	2	2
0	1	0	1
0	1	1	2
0	1	2	3
0	2	0	2
0	2	1	3
0	2	2	4
0	3	0	3
0	3	1	5
0	4	0	5
1	0	0	1
1	0	1	3
1	0	2	4
1	0	3	6
1	1	0	3
1	1	1	5
1	1	2	7
1	1	3	9
1	2	0	5
1	2	1	7
1	2	2	10
1	2	3	12
1	3	0	8
1	3	1	11
1	3	2	14
1	3	3	18
1	3	4	20
1	4	0	13
1	4	1	17
1	4	2	20
1	4	3	30
1	4	4	35
1	4	5	40
1	5	0	25
1	5	1	35
1	5	2	50
1	5	3	90
1	5	4	160
1	5	5	180+

3) Investigación de Pseudomona sp

Los procesos productivos en organizaciones de bienes o servicios, generan diferentes residuos de tipo sólido, líquido o gaseoso, que según el proceso, pueden contener algunas sustancias químicas que contribuyen a la contaminación del medio ambiente. En el caso de los residuos líquidos, también llamados vertimientos, que regularmente son descargados a las líneas de alcantarillados como disposición final y otras veces, a sitios de almacenamiento o tanques antes de su eliminación, hecho que propicia condiciones ambientes especiales para que ecosistemas microbianos tengan condiciones especiales para su crecimiento y conservación. 

Entre éstos ecosistemas, se encuentran las bacterias del género Pseudomonas (antiguamente llamadas Bacilos piociánicos), que tienen alta adaptabilidad a utilizar una gran variedad de sustancias químicas como fuente de carbono, nitrógeno y energía. Esta adaptación, es un proceso catabólico que implica la producción de enzimas degradativas que han sido codificadas por genes adquiridos y por procesos de transferencia horizontal, muy común en las bacterias Gram negativas, y en donde interviene el DNA extracromosomal como son los plásmidos o por mecanismos genómicos como son los transposones. Agar Cetrimide es un medio sólido específico para el crecimiento de Pseudomona aeuroginosa al tener componentes que favorecen su aislamiento y al estar en los laboratorios como medio de uso común para la recuperación de este microorganismo y otras especies, se pretende ver si se pueden aislar directamente de estas muestras ambientales, teniendo en cuenta el número de células que haya o la concentración de sustancias químicas que tenga. 

Se siembra desde el tubo de la muestra problema en superficie, y en estrías, incubando la placa por 24 hs a 37° C. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa.  Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 37º C por otras 24 horas.y a partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado. Para la prueba de la oxidasa, en una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro.  El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva. Otras pruebas que se pueden investigar son: Prueba de reducción del nitrato, Prueba de licuefacción de la gelatina, Prueba del gluconato y Prueba del Citrato. Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, oxidasa positivo, móvil, produce dos tipos de pigmentos (piocianina y fluoresceína), aunque existen clases no pigmentadas, reduce nitratos a nitrito y produce gas (esto último no siempre es positivo), licúa la gelatina en forma rápida, reduce el gluconato.

Bacteria	Gram	Oxidasa	Nitrato	Gluconato	Gelatina
Pseudomona aeruginosa	-	+	+	+	+

"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HÁBITO"

ARISTOTELES

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