GUÍA PRACTICA DEL LABORATORIO MICROBIOLOGICO DE AGUAS Y ALIMENTOS (PARTE 5)

Técnicas de Laboratorio y marchas clásicas

a. AGUA

El agua es un componente de nuestra naturaleza que ha estado presente en la Tierra desde hace más de 3.000 millones de años, ocupando tres cuartas partes de la superficie del planeta. Su naturaleza se compone de tres átomos, dos de hidrógeno y uno de oxígeno, y que unidos entre si forman una molécula de agua (H₂O), la unidad mínima en que ésta se puede encontrar.

La forma en que estas moléculas se unen entre sí determinará la forma en que encontramos el agua en nuestro entorno; como líquidos, en lluvias, ríos, océanos, como sólidos en témpanos y nieves o como gas en las nubes. El agua es una sustancia muy sencilla, pero posee un conjunto de propiedades que la hacen única lo que, unido a su abundancia, le otorgan una gran importancia en el ciclo biológico del planeta.

Entre sus notables propiedades se encuentran:

1) El agua puede encontrarse en la naturaleza en sus tres estados, sólido, líquido y vapor, pudiendo existir en un momento dado en equilibrio entre sus tres formas.

2) El hielo tiene una densidad inferior a la del agua líquida, (0,92 veces) y flota, lo que tiene gran importancia para la vida en mares, lagos, etc.

3) El calor específico del agua es muy alto (1 cal/gr.ºC).

4) El calor latente de vaporización del agua es muy grande: a 20º C hay que comunicar 585 cal. para evaporar un gramo de agua.

5) La conductividad térmica del agua es la mayor de todos los líquidos, con la única excepción del mercurio.

6) La estructura molecular del agua es un dipolo: su constante dieléctrica es muy alta, mayor que para cualquier otro líquido, lo que le confiere la propiedad de disolver cualquier sustancia aunque sea en cantidades extremadamente pequeñas. Ello hace que el agua no sea nunca químicamente pura, llevando siempre diversas sustancias, como gases, sales o grasas, disueltas.

7) El agua es débilmente ionizable, conteniendo siempre algunos iones hidrógeno, dando un pH próximo a 6. La concentración de iones en el agua es muy importante para los organismos.

Veremos a continuación un esquema que ejemplifica de manera sencilla el complejo ciclo del agua el la naturaleza:

La calidad del agua, es un estado de ésta, caracterizado por su composición físico – química y biológica. Este estado deberá permitir su empleo sin causar daño, para lo cual deberá  reunir dos características:

1. Estar exenta de sustancias y microorganismos que sean peligrosos para los consumidores.

2. Estar exenta de sustancias que le comuniquen sensaciones sensoriales desagradables para el consumo (color, turbiedad, olor, sabor).

El criterio de potabilidad del agua depende fundamentalmente del uso al que se la destina (humano, industrial, agrícola, etc). Agua potable es el agua, ya sea de superficie o subterránea , tratada y el agua no tratada por no estar contaminada. La definición de agua potable se ha ido adaptando al avance del conocimiento científico y a las nuevas técnicas, en especial a las relacionadas con el análisis de contaminantes.  La mala calidad del agua afecta a infinidad de actividades vitales, es un bien tan preciado que en la exposición de la Carta Europea del Agua comienza con “Sin agua no hay comida, no hay bebida, ni luz, ni calor, ni lluvia. ¡Sin agua no hay vida posible!”

Hasta hace unas decenas de años la calidad de un agua destinada a un abastecimiento se centraba principalmente en que el agua estuviera exenta de sabores, olores, no fuera muy dura y no contuviera bacterias patógenas, confiándose en gran medida en que el poder autodepurador de los embalses o ríos, y la protección de las zonas de captación eran suficientes para lograr una aceptable calidad que se completaría con un tratamiento simple de decantación, filtración y desinfección, así como hacer determinadas comprobaciones generalmente bacteriológicas del agua en la red, ausencias de sabores y olores y presencia de ligeras concentraciones del desinfectante empleado. Hoy día y más aún de cara al futuro, y como consecuencia de la polución creciente y los mayores avances de la técnica y la ciencia hay que considerar además otros caracteres que inciden de forma perjudicial en la salud del consumidor (pesticidas, detergentes, subproductos de la desinfección y otras sustancias orgánicas e inorgánicas así como protozoos, virus, bacterias,).

El análisis del agua en su origen, nos proporciona los primeros datos respecto a su calidad, orientándonos en la selección de su captación y facilitando el tratamiento que hemos de aplicarle posteriormente. Un agua potable destinada al consumo humano, debe cumplir ante todo con una calidad sanitaria apta, tanto inmediatamente después de su proceso de tratamiento, como presentar una estabilidad biológica en la red de distribución. 

Definición de “AGUA POTABLE”, según el Código Alimentario Argentino Actualizado - Artículo 982 - (Res MSyAS N° 494 del 7.07.94):

Con las denominaciones de Agua potable de suministro público y Agua potable de uso domiciliario, se entiende la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud. Deberá presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente.

  

A nivel mundial, el 80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales y una tercera parte de las defunciones causadas por éstas se deben al uso y consumo de agua insalubre. La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en países en desarrollo. El agua y los alimentos contaminados se consideran como los principales vehículos involucrados en la transmisión de bacterias, virus o parásitos. Los organismos transmitidos por el agua habitualmente crecen en el tracto intestinal y abandonan el cuerpo por las heces. Dado que se puede producir la contaminación fecal del agua (si ésta no se trata adecuadamente) al consumirla, el organismo patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador. Como el agua se ingiere en grandes cantidades, puede ser infecciosa aun cuando contenga un pequeño número de organismos patógenos.

Los microorganismos patógenos que prosperan en los ambientes acuáticos pueden provocar cólera, fiebre tifoidea, disenterías, poliomelitis, hepatitis y salmonelosis, entre otras enfermedades. El agua y alimentos contaminados tienen una gran importancia en la transmisión de patógenos causantes del síndrome diarreico, por lo que se hace necesario tener estrategias que permitan un manejo adecuado de ella.  La OMS calcula que la morbilidad (número de casos) y mortalidad (número de muertes) derivadas de las enfermedades más graves asociadas con el agua se reduciría entre un 20 y un 80 por ciento, si se garantizara su potabilidad y adecuada canalización. El agua hace posible un medio ambiente saludable pero, paradójicamente, también puede ser el principal vehículo de transmisión de enfermedades. Las enfermedades transmitidas por el agua son enfermedades producidas por el "agua sucia" (agua que se ha contaminado con desechos humanos, animales o químicos).

Mundialmente, la falta de servicios de evacuación sanitaria de desechos y de agua limpia para beber, cocinar y lavar es la causa de más de 12 millones de defunciones por año. Se estima que 3.000 millones de personas carecen, por ejemplo, de servicios higiénicos. Más de 1.200 millones de personas están en riesgo porque carecen de acceso a agua dulce salubre. En lugares que carecen de instalaciones de saneamiento apropiadas, las enfermedades transmitidas por el agua pueden propagarse con gran rapidez. Esto sucede cuando excrementos portadores de organismos infecciosos son arrastrados por el agua o se lixivian hasta los manantiales de agua dulce, contaminando el agua potable y los alimentos.  La magnitud de la propagación de estos organismos infecciosos en un manantial de agua dulce determinado depende de la cantidad de excremento humano y animal que éste contenga. Dado que se puede producir la contaminación fecal de los abastecimientos de agua, si el agua no se trata adecuadamente, el patógeno puede penetrar en un nuevo hospedador, al consumirla. Las enfermedades diarreicas, las principales enfermedades transmitidas por el agua, prevalecen en numerosos países en los que el tratamiento de las aguas residuales es inadecuado. Los desechos humanos se evacuan en letrinas abiertas, canales y corrientes de agua, o se esparcen en las tierras de labranza. Las afecciones que se propagan por el agua se conocen como "enfermedades transmitidas por el agua". Sus agentes patógenos son biológicos, más que químicos, y los males que provocan casi siempre son contagiosos. Por lo general, los agentes patógenos pertenecen al grupo de los microorganismos, que se transmiten en la heces excretadas por individuos infectados o por ciertos animales.

De forma que estas enfermedades se suelen contraer al ingerirlos en forma de agua o de alimentos, contaminados por esas heces (vía fecal – oral). Los patógenos humanos transmitidos por el agua incluyen muchos tipos de microorganismos tales como: bacterias, Virus, protozoos y, en ocasiones, helmintos (lombrices), todos ellos muy diferentes en tamaño, estructura y composición.  A causa de las enfermedades de origen hídrico y el interés de controlarlas, los estudios bacteriológicos del agua se han orientado, en su mayor parte, hacia sus aspectos sanitarios. Uno de los criterios, utilizado para determinar la calidad sanitaria del agua, es la clase y número de bacterias que se encuentran presentes. En general, los métodos utilizados están diseñados para detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de microorganismos indicadores más que para la determinación de patógenos.

Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los microorganismos patógenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de números altos de otros microorganismos, o tienen una distribución irregular en el producto.  Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han hecho que se utilicen grupos de microorganismos de detección y cuantificación más fáciles y cuya presencia en cierto número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos y/o permitir la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de microorganismos se denominan “indicadores”. Éstos son organismos habitualmente asociados al tracto intestinal, cuya presencia en el agua indica que el agua ha recibido una contaminación de origen intestinal.

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bacilos Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 37º C.  Incluye a los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros géneros. En la práctica, los organismos coliformes son siempre miembros del grupo de las bacterias entéricas. Estas bacterias son adecuadas como indicadores porque son habitantes comunes del tracto intestinal, tanto de las personas como de los animales de sangre caliente, donde están presentes en grandes cantidades. También interesa la determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes presentes en intestinos y materias fecales del hombre o animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto proporciona información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente.

Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el Número Más Probable (NMP), aunque se han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de análisis, con el objetivo de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión, hasta el punto que se ha llegado a aceptar como método estándar.  Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas a partir de lactosa a 37ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos roscados de Caldo Mac Conkey que contiene lactosa, y agregando una campana de Durham o tubo de fermentación invertido, que permite recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se realiza con base en el hecho de que pueda producir gas desde lactosa, en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no (Caldo BRILA: Verde Brillante Bilis Lactosa).

También es utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, que puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y con el que se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Las bacterias coliformes dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 h de incubación a 37ºC. La determinación de coliformes fecales se hace a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medios selectivos e incubando a 44,5ºC.  Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimático. En este caso, el grupo de coliformes totales incluye todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza un sustrato cromogénico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que rompe el sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorógeno. Este método permite llevar a cabo tanto recuentos como ensayos de ausencia/presencia.

También se usa como indicador de contaminación fecal la presencia de Enterococcus faecalis. El hábitat normal de Enterococcus faecalis es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto, son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ríos, etc. La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas en cuanto a sus posibles huéspedes.  Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colífagos, que son bacteriófagos de coliformes, es decir, se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo con estudios de correlación entre números de colifagos y coliformes en agua, se podría utilizar el índice de colífagos como índice de calidad sanitaria del agua. Además, como son más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección que estos últimos.

Las materias fecales del hombre y de los animales contienen una gran variedad de microorganismos enteropatógenos como Campylobacter, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Pasteurella, Francisella, Leptospira, Vibrio, protozoarios y varios grupos de virus.  Cuando estos microorganismos son descargados en aguas naturales, su presencia denota contaminación fecal y constituyen un riesgo de trasmisión de enfermedades para la población humana (Borrego et al., 1990).  Las bacterias enteropatógenas por lo general aparecen en cantidades bajas en aguas naturales, razón por la cual su detección en el laboratorio se logra con cierta dificultad. Por otro lado, las técnicas de cultivo para su aislamiento son complejas y laboriosas. Estas desventajas han llevado a diseñar técnicas microbiológicas para el análisis de agua basadas en la detección de otros microorganismos presentes en las materias fecales y que puedan servir de indicadores (Borrego et al., 1990).

Aunque los Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Enterococos y Escherichia coli son utilizados como indicadores de contaminación fecal, su uso ha presentado algunas desventajas, ya que han sido reportados casos de enfermedades entéricas por consumo de agua en la cual no se había detectado coliformes. Además, ninguno de estos microorganismos sirven como indicadores de contaminación viral (Borrego et al., 1987). Por esto los virus de Escherichia coli conocidos como colifagos pueden ser mejores indicadores de contaminación fecal. La presencia de colifagos en heces humanas y desagües es constante y su detección es fácil y rápida (Wentsel et al., 1982; Cornax et al., 1991). Los colifagos son virus que infectan células de E. coli y han sidoaisladas fácilmente de aguas contaminadas conjuntamente con los coliformes totales y termotolerantes (Grabow et al. 1984). Además de ser indicadores de contaminación fecal son también considerados como indicadores de la presencia de enterovirus en aguas naturales y tratadas (IAWPRC, 1991). Estudios sobre aguas han sugerido el uso de los colifagos como indicadores de la eficacia del proceso de remoción microbiana en plantas de tratamiento durante la potabilización del agua (Jofre et al., 1995). Esto se debe a la capacidad de estos virus de ser más resistentes al proceso de tratamiento del agua que las bacterias indicadoras convencionales (Payment & Franco, 1993). El método de cuantificación se basa en la formación de placas de lisis. Los colífagos (bacteriófagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y la liberación de partículas virales que infectarán las células bacterianas adyacentes.

A medida que las bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada, determinando las conocidas como “placas de lisis”. La cepa utilizada en los ensayos es una E. coli sensible a la infección por colífagos (ATCC 13706). La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en los países en desarrollo.  Los procedimientos sanitarios pueden aplicarse bien para evitar la contaminación del agua o bien para destruir el patógeno que ya se encuentre presente en ella. Los programas de depuración de agua han sido responsables de la disminución de las infecciones transmitidas por agua. La eliminación de la turbidez del agua por filtración, proporciona un significativo descenso en la carga microbiana del agua. Pero la filtración, por sí sola, tiene sólo un valor parcial, porque muchos organismos son filtrables. A diferencia del tratamiento con cloro que ha demostrado ser eficaz en la disminución de la incidencia de enfermedades transmitidas por agua. El agua puede contaminarse en la fuente de suministro, por el ingreso de contaminantes durante la distribución del agua y dentro de la vivienda, por el uso de recipientes mal protegidos o por la manipulación insalubre del agua, aún cuando la fuente se encuentre razonablemente protegida. Por ello, para ayudar a prevenir las enfermedades transmitidas por agua, deberían tomarse algunas medidas sencillas como:  Hervir el agua hasta que comience a evaporarse, desinfectar el agua colocando dos gotas de cloro por litro de agua, durante media hora, antes de su consumo y lavarse las manos después de ir al baño y antes de manipular alimentos.

La investigación microbiológica de la potencial contaminación del Agua Potable de bebida se centraliza en tres exámenes de rutina a saber, NORMATIZADAS en el Código Alimentario Argentino Actualizado: 

1) Recuento de Aerobios Mesófilos, por siembra en profundidad.

2) Recuento de Coliformes totales y fecales por técnica del NMP.

3) Presencia de Pseudomona sp. por siembra en superficie.

Los criterios microbiológicos para los tres ensayos, serán ,los siguientes:

1) Aerobios Mesófilos a 37° por 24 horas: hasta 300 ufc/ml, en Agar para recuento en placa.

2) Coliformes: hasta 3 / 100ml según MNP a 37° C por 48 hs en Caldo Mac Conkey.

3) Pseudomona sp: Ausencia en 100 ml, en Agar Cetrimide a 37° C por 48 hs.

4) Escherichia coli: Ausencia en 100 ml, en Caldo Brila a 44° C por 48 hs, repicado en EMB de Levine y cotejado por Pruebas INViC.

Las muestras de agua para análisis bacteriológico siempre deben ser tomadas en envases esterilizados. El procedimiento para tomar las muestras de agua es el siguiente:

• Obtener un envase estéril que puede ser el utilizado para urocultivo, o en su defecto, un frasco de vidrio de boca ancha y con tapa roscada.
• Elejir el grifo de agua fría del cual se va a tomar la muestra. Quitar filtros y oxigenadores si los tuviere, así como cualquier otro adminículo, como mangueras, etc. No tomar muestras de: un grifo de agua caliente, un grifo que mezcle agua fría y agua cliente; un grifo que gotee; cualquier grifo que entregue agua suavizada, filtrada o de otra manera tratada; o de una manguera conectada a un grifo.
• Esterilizar la superficie interna del grifo con la llama de un hisopo de algodón embebido en alcohol (un encendedor de gas butano desechable también sirve). No limpiar el grifo después de esterilizarlo.
• Lavarse las manos antes de tomar la muestra.
• Dejar correr el agua a chorro abierto por 5 minutos, aproximadamente, para evacuar la tubería y hacer correr el agua fresca.
• Reduzca el caudal del agua al tamaño de un lápiz para tomar la muestra.
• Abrir el envase esterilizado con cuidado. Sostener la tapa en una mano y el envase en la otra (mantener la tapa en la mano y no tocar la superficie interior de la tapa o del envase). Llenar la botella completamente sin que se derrame el agua y no dejar que el agua pase encima de su mano al entrar en el envase.
• Tapar el envase inmediatamente después de tomada la muestra.
• Refrigerar la misma y llevar al laboratorio, en una cubeta con hielo, tan pronto como sea posible (dentro de seis horas es recomendado pero se puede tardar hasta 30 horas, refrigerando sin congelar).

 

1) Recuento de Aerobios Mesófilos Totales:

Se obtiene la muestra tomada de un grifo previamente flameado, se llevan a un frasco estéril 10 ml de esta muestra y 0,1 de peptona y se realizan diluciones seriadas de 10^-1, 10^-2 y 10^-3 (esto en el caso de no ser agua de red domiciliaria oficial).  Se procede a realizar la siembra en profundidad: se colocan en la placa de Petri y con pipeta estéril 0,1 ml de cada dilución y luego se vierte Agar para Recuento en Placa (PCA) a 45° - 50° C. incubándose a 37° C por 24 a 48 hs. El CAA determina un criterio microbiológico de hasta 300 ufc (Unidades formadoras de colonia) x ml para agua potable y de hasta 10⁵ para aguas minerales.

2) Recuento de Coliformes:

Aquí utilizamos la Técnica del Número más Probable (NMP) que es una combinación estadísticamente probada de tubos con Caldo Mac Conkey (simple y doble concentración) versus cantidades igualmente ya estimadas del agua problema a analizar. Estas combinaciones aparecen eln las Tablas de MNP y de allí obtenemos el resultado estimado de cuántos coliformes tenemos por 100 ml de agua a estudiar luego de 48 hs. de incubacion a 37° C.  Personalmente utilizo la siguiente combinación: 1 tubo con 10 ml de Caldo mac Conkey concentración doble más 10 ml de agua problema; 3 tubos con 10 ml de Caldo Mac Conkey concentración simple con 1 ml de agua problema cada uno y 1 tubo con 10 ml de Caldo Mac Conkey simple concentración, mas 0,1 ml de agua a estudiar.

Toda ésta batería ex por cada muestra a analizar. Los tubos son roscados y con campana de Durham, y serán (+) los que desarrollen gas, viren el color púrpura del medio a marillo o ambas cosas. Por supuesto, luego pasamos a medios selectivos de identificación bacteriana y finalmente a las pruebas INViC, que nos darán el nompre y el apellido del coliforme presente.

Asimismo, se siembran de cada muestra, 10 ml de agua problema en tubos roscados con capana de Durham, conteniendo 10 ml de Caldo Brila, los cuales se llevan en un Baño María a 44° C por 48 hs. Se sigue con los (+) el mismo procedimiento o marcha que con los tubos de Agar Mac Conkey.

Cuando no hay formación de gas en 48 horas de incubación la prueba se considera negativa en ambas temperaturas: 37° C y 44° C. Si hubiesen tubos (+) se hará el siguiente paso:

a) De la batería del NMP, se tomará el tubo (+) que contenga más concentración de agua problema, y se sembrará en una placa de Agar Mac Conkey en estrías (en superficie), incubándola 24 hs a 37° C. Esto debe hacerse con cada batería en donde existan tubos (+), identificando correctamente cada muestra.

b) Con respecto al o a los tubos (+) de Caldo Brila, el proceso será similar a 1), pero se cambiará el medio sólido utilizado anteriormente por Agar EMB de Levine.

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos peritricos que desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de lactosa y a veces también de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos.  Para enjuiciar la calidad de las aguas se recurre a parámetros físicos, químicos y biológicos. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos; es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coliformes y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de E. coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producción de gas y ácido.

Las bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombre y animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino. Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaeróbios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a gran abundancias en medios corrientes, como caldo y agar.  Las colonias de E. Coli que desarrollan en Agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) de Levine, tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Asimismo, se deben realizar las llamadas Pruebas de Identificación Bioquímica o Pruebas IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Voges – Proskauer (V.P.) y Citrato).

La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli (+ + - -), significa que produce Indol, es positivo al rojo de metilo y negativo al V.P. y al Citrato. Hay 16 combinaciones posibles de resultados prueba negativa y positiva.

Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de muestra.

Nº de tubos positivos	Índice NMP/100ml	Límite de confianza de 95 %
		Inferior	Superior
0	< 2,2	0	6
1	2,2	0,1	12,6
2	5,1	0,5	19,2
3	9,2	1,6	29,4
4	16	3,3	52,9
5	> 16	8	infinito

Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de muestra.

Nº de tubos positivos	Índice NMP/100ml	Límite de confianza de 95 %
		Inferior	Superior
0	< 1,1	0	3
1	1,1	0,03	5,9
2	2,2	0,26	8,1
3	3,6	0,69	10,6
4	5,1	1,3	13,4
5	6,9	2,1	16,8
6	9,2	3,1	21,1
7	12	4,3	27,1
8	16,1	5,9	36,8
9	23	8,1	59,5
10	> 23	13,5	Infinito

Número más probable por 100 ml. Usando un tubo de 50 ml, cinco tubos de 10 ml y cinco tubos de 1 ml

Tubos de 50 ml positivos	Tubos de 10 ml positivos	Tubo de 1 ml positivos	NMP por 100 ml
0	0	0	0
0	0	1	1
0	0	2	2
0	1	0	1
0	1	1	2
0	1	2	3
0	2	0	2
0	2	1	3
0	2	2	4
0	3	0	3
0	3	1	5
0	4	0	5
1	0	0	1
1	0	1	3
1	0	2	4
1	0	3	6
1	1	0	3
1	1	1	5
1	1	2	7
1	1	3	9
1	2	0	5
1	2	1	7
1	2	2	10
1	2	3	12
1	3	0	8
1	3	1	11
1	3	2	14
1	3	3	18
1	3	4	20
1	4	0	13
1	4	1	17
1	4	2	20
1	4	3	30
1	4	4	35
1	4	5	40
1	5	0	25
1	5	1	35
1	5	2	50
1	5	3	90
1	5	4	160
1	5	5	180+

3) Investigación de Pseudomona sp:

Los procesos productivos en organizaciones de bienes o servicios, generan diferentes residuos de tipo sólido, líquido o gaseoso, que según el proceso, pueden contener algunas sustancias químicas que contribuyen a la contaminación del medio ambiente. En el caso de los residuos líquidos, también llamados vertimientos, que regularmente son descargados a las líneas de alcantarillados como disposición final y otras veces, a sitios de almacenamiento o tanques antes de su eliminación, hecho que propicia condiciones ambientes especiales para que ecosistemas microbianos tengan condiciones especiales para su crecimiento y conservación.

Entre éstos ecosistemas, se encuentran las bacterias del género Pseudomonas (antiguamente llamadas Bacilos piociánicos), que tienen alta adaptabilidad a utilizar una gran variedad de sustancias químicas como fuente de carbono, nitrógeno y energía. Esta adaptación, es un proceso catabólico que implica la producción de enzimas degradativas que han sido codificadas por genes adquiridos y por procesos de transferencia horizontal, muy común en las bacterias Gram negativas, y en donde interviene el DNA extracromosomal como son los plásmidos o por mecanismos genómicos como son los transposones.

Agar Cetrimide es un medio sólido específico para el crecimiento de Pseudomona aeuroginosa al tener componentes que favorecen su aislamiento y al estar en los laboratorios como medio de uso común para la recuperación de este microorganismo y otras especies, se pretende ver si se pueden aislar directamente de estas muestras ambientales, teniendo en cuenta el número de células que haya o la concentración de sustancias químicas que tenga.

Se siembra desde el tubo de la muestra problema en superficie, y en estrías, incubando la placa por 24 hs a 37° C. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa.  Si hay colonias típicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 37º C por otras 24 horas.y a partir del agar nutritivo hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado. Para la prueba de la oxidasa, en una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro.

 El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva. Otras pruebas que se pueden investigar son: Prueba de reducción del nitrato, Prueba de licuefacción de la gelatina, Prueba del gluconato y Prueba del Citrato. Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, oxidasa positivo, móvil, produce dos tipos de pigmentos (piocianina y fluoresceína), aunque existen clases no pigmentadas, reduce nitratos a nitrito y produce gas (esto último no siempre es positivo), licúa la gelatina en forma rápida, reduce el gluconato.

Bacteria	Gram	Oxidasa	Nitrato	Gluconato	Gelatina
Pseudomona aeruginosa	-	+	+	+	+

b. ALIMENTOS

Hay una serie de razones que justifican la necesidad de analizar los alimentos para determinar cualitativa o cuantitativamente sus microorganismos. los principales objetivos del analisis microbiológico son asegurar:

(1) que el alimento cumple ciertas normas estatutarias; (2) que se ajusta a normas internas establecidas por la compañia procesadora y a las externas exigidas por el comprador; (3) que las materias alimenticias que llegan a la factoría para ser procesadas cumplen las normas exigidas y las pactadas con el productor; (4) que se mantienen el control del proceso y la higiene de la línea de fabricación.

Los métodos del examen microbiológico utilizados para controlar la calidad del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran parte, del alimento que va a ser analizado.

Conviene estudiar los análisis bajo los siguientes encabezamientos:

1. Estimación del número total de microorganismos.

2. Estimación del número de microorganismos indicadores.

3. Examen o estimación del número de microorganismos alterantes de los alimentos y de otros grupos especiales.

4. Examen o estimación del número de microorganismos productores de toxiinfecciones alimentarias y de los microorganismos patógenos transportados por los alimentos.

5. Análisis de los productos metabólicos de los microorganismos; a menudo requieren técnicas más sofisticadas de las que sólo disponen los laboratorios mejor dotados.

Uno de los mayores problemas del análisis microbiológico de los alimentos es determinar el número de muestras de un lote o de un día de trabajo que deben analizarse para asegurar que el producto o material alimenticio cumple la norma exigida. Obviamente cuanto mayor sea el número de muestras tomadas, mayor será la confianza en los resultados, pero puesto que el alimento empleado con fines analíticos representa un gasto no recuperable, debe alcanzarse un compromiso entre la exactitud de los resultados y la economía del análisis. los esquemas de muestreo, actualmente en uso, implican el análisis de cinco o diez muestras por lote, o de la raíz cuadrada del número de envases por lote; sin embargo, podría arguirse que una cantidad tan grande de muestras está totalmente injustificada cuando se obtienen resultados concordantes buenos.

Por lo tanto, las fuentes microbianas disponibles deben usarse prudentemente y el muestreo será máximo con los alimentos que se sabe que son microbiológicamente peligrosos y con los que dan resultados erráticos; el muestreo será también grande con los que se han sometido a un cambio de procesado y siempre que haya tenido lugar un fallo en la línea de procesado. También debe tenerse en cuenta que el número de análisis se ve afectado por la razón o causa que lo motiva; así, se necesitan menos pruebas para la confirmación de un estándar o norma satisfactorio que cuando el fin perseguido es la eliminación de un producto no satisfactorio.  Cualquier esquema de muestreo digno debe tener una base estadística y a los lectores que necesiten mayor información sobre tales esquemas les recomiendo la lectura de Microorganismos de los alimentos, Vol. 2 (Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos, ICMSF, 1974* - *Esta obra ha sido publicada en español por EDITORIAL ACRIBIA, S. A., Zaragoza) en donde encontrarán todos los datos que precisen.

La Comisión Internacional (ICMSF), citada en el punto anterior, define a la “muestra representativa” como aquélla cuyo estado es tan parecido como sea posible a la del lote (o partida) del que se tomó. Por lo tanto, es necesario evitar todo tipo de perjuicio y asegurarse de que se toman suficientes muestras. Como mejor se realiza esto es mediante el muestreo al azar, utilizando tablas de números aleatorios según recomienda la Comisión (ICMSF, 1974).

Sin embargo, debe tenerse en cuenta el posible aumento de microorganismos en el equipo y por lo tanto en el alimento, durante la producción de una partida; el producto suele contener muchos menos microorganismos al comienzo que a la terminación del trabajo de la fábrica, lo que deberá tenerse presente en cualquier esquema de muestreo. De otra parte si el equipo se ha limpiado mal, los alimentos pueden contaminarse mucho al iniciarse el trabajo. En consecuencia puede ser ventajoso retirar los productos a intervalos de tiempo regulares; ello no supone una depreciación del muestreo al azar y se emplea frecuentemente.

Otras dificultades del muestreo derivan de la consistencia heterogénea del producto alimenticio y si el alimento no es homogéneo se requiere un muestreo más frecuente. Como ejemplos extremos se pueden citar la leche, de la que sólo se requiere una pequeña muestra del alimento bien mezclado y algunos de los productos actuales, compuestos de múltiples ingredientes, lo que puede hacer imposible obtener la cantidad requerida de cada uno para contar con una muestra representativa; consecuentemente debe hacerse un análisis por separado de cada componente. Cuando los microorganismos se limitan a zonas específicas del alimento el muestreo es en ocasiones deliberadamente desequilibrado, por ejemplo, en alimentos como la carne, el pescado y la fruta la mayoría de sus microorganismos se localizan en las superficies externas y son éstas, por lo tanto, las que constituyen las principales regiones de muestreo.

Los alimentos líquidos no presentan problemas y corrientemente se muestrean con pipetas después de mezclarse bien. Los alimentos sólidos los presentan a menudo, por lo que para superar las dificultades de la toma de muestras se utilizan diversas técnicas. En alimentos cuyas unidades son relativamente manejables, como aves y pescado, la canal entera se lava con agitación en un medio de muestreo líquido, si bien se admite que con tal tratamiento sólo se recupera una parte de la flora; se obtienen recuentos mayores si se incluyen en la solución de lavado abrasivos, como arena estéril. Durante muchos años se han usado mucho para el muestreo de superficies las torundas de algodón húmedo, pues tienen la ventaja de ser de fácil manejo y cuando se utilizan conjuntamente con una lámina metálica, dotada de ventana, permiten la toma de muestra de una área superficial equivalente; después de frotada dicha área, el soporte de la torunda se rompe y aquélla se separa y deja caer en un diluyente agitándose entonces para separar los microorganismos del algodón.

Las recuperaciones alcanzadas con estas técnicas de la torunda son pobres, debido a la adherencia de los microorganismos a la superficie del alimento y a su retención en la torunda, pero pueden mejorarse, si al área muestreada vuelve a frotarse con otra torunda seca. los métodos del agar de contacto, en los que un medio estéril sólido a base de agar se presiona contra la superficie a muestrear, dan recuentos todavía menores que los de las técnicas de la torunda, pero constituyen el sistema de muestreo de uso más sencillo ya que el medio puede someterse a incubación directamente (Cate, 1965). En el caso de carnes, pescados y aves, los recuentos más altos se obtienen con el llamado «muestreo destructivo». Pueden tomarse muestras con sacabocados preesterilizados, lo que tiene la ventaja de que se analiza una área superficial conocida que varía con el diámetro del sacabocados utilizado. Escalpelos y cuchillas también son bastante populares, pero con tales instrumentos la relación área superficial/volumen es imposible de controlar.

También pueden tomarse muestras de áreas conocidas empleando un escarificador dérmico y un cilindro metálico estéril que contiene el diluyente (Barnes et al., 1973). Las carnes picadas y los alimentos graniformes, como guisantes y harina, son más fáciles de muestrear ya que pueden tomarse pesos conocidos. Algunas de las técnicas de muestreo microbiano estudiadas más atrás sirven también para el examen del equipo de procesado de los alimentos, por ej., el lavado con un volumen conocido de agua o de diluyente, el empleo de torundas, posiblemente con lámina metálica y los métodos del agar de contacto.

Excepto cuando se emplean torundas o lavados, se toma un peso conocido de la muestra del alimento (por ej., 10 ó 25 g). El alimento se adiciona a un diluyente estéril adecuado, como solución de Ringer diluida al 1/4 o agua de peptona al 0,1 % y se trata a continuación de forma que se liberen en el diluyente los microorganismos del alimento. El tratamiento implica un mezclado mecánico o un pase por el Stomacher. En esta última técnica, muy popular actualmente, la muestra, junto con un volumen conocido de diluyente, se coloca en una bolsa de plástico estéril que es golpeada por una especie de paletas en el interior del Stomacher. El volumen de diluyente utilizado generalmente es nueve veces mayor que la muestra (por ej., 25 g de guisantes en 225 ml de diluyente) de forma que se obtenga un homogeneizado 10^-1, a partir del cual se preparan las correspondientes diluciones (10^-2, 10^-3, 10^-4, etc.) dependiendo de la calidad microbiológica del alimento o superficie objeto del análisis.

Una de las pruebas microbiológicas más corrientes llevadas a cabo en los alimentos es el recuento viable total, conocido también como recuento estándar en placa y recuento aeróbico en placa. Para ello se siembran diluciones adecuadas de una muestra de los alimentos en medios de agar que contienen nutrientes suficientes para permitir el crecimiento del mayor número posible de microorganismos. los nutrientes de que se compone, por ejemplo el agar nutritivo, (Nutritive Agar, Oxoid) son: extracto de carne, extracto de levadura y peptona (un hidrolizado enzimático de carne fresca que contiene diversas sales inorgánicas, factores de crecimiento y péptidos). El pH del medio se ajusta generalmente a 7 – 7,4 para recuperar las bacterias y no los mohos y levaduras.

Las células bacterianas individuales, transferidas a la placa con el diluyente, se multiplican normalmente durante la incubación. Así puede hacerse una estimación del número total de células viables (es decir, células capaces de crecer en el medio de recuperación) en la dilución sembrada, calculando después de la incubación el recuento del número total de colonias bacterianas que se desarrollan; naturalmente en las condiciones aerobias normales crecerán las aerobias obligadas y las aerobias facultativas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. Las temperaturas de incubación seleccionadas dependen del alimento que va a examinarse. Las temperaturas corrientemente utilizadas son 45º C para las termófilas, 37º C para las mesófilas y 20º C para mohos y levaduras. Mientras la última temperatura es conveniente para las bacterias psicrótrofas y también para muchas mesófilas, para una estimación más exacta de las psicrótrofas se utilizan a veces temperaturas más bajas (por ej., 1 – 7º C); debe recordarse siempre que ninguna temperatura de incubación excluye por completo a todos los microorganismos de otro grupo.

Son muchas las técnicas en placa empleadas para la enumeración del número total de bacterias viables, de las que describiremos brevemente cinco. La enumeración de las colonias se lleva a cabo tradicionalmente de forma manual, con el empleo de un contador de colonias iluminado, con cuya ayuda el laborante cuenta cada colonia individual (véase más abajo). Esta operación puede ser tediosa e inexacta, salvo que en el medio de cultivo haya crecido un número adecuado de colonias (idealmente menos de 300, si bien por razones estadísticas se requieren también como mínimo 30 colonias). En los últimos años se han ideado una serie de instrumentos de recuento automático de colonias que permiten obtener en pocos segundos recuentos exactos.

En el método de vertido en placa, se vierten en una serie (o mejor dos series) de placas de Petri alicuotas de 1 ml de las diluciones apropiadas del alimento. A continuación se adicionan a cada placa unos 10 – 15 ml de agar nutritivo fundido, enfriado a 45º C, y se mezcla cuidadosamente con la alícuota correspondiente. Después de solidificado el agar, se incuban las placas a la temperatura requerida durante un tiempo que depende de las condiciones de incubación (por ej., 1 – 2 días a 37º C, 3 – 4 días a 20º C y 7 – 10 días a 5º C). Después de la incubación se contarán las colonias de las placas que contienen entre 30 y 300 colonias; a partir de este recuento puede calcularse fácilmente el número de bacterias viables por gramo (o por cm²) de alimento.

En el método de extensión en placa, se vierte previamente el medio en placas de Petri y se deja solidificar; a continuación se extienden uniformemente por la superficie alicuotas de 0,1 ml de las correspondientes diluciones mediante el empleo de varillas de vidrio estériles en forma de L (Espátula de Drigalsky).  Las placas se incuban como antes. Las ventajas de esta técnica son: primero que las células bacterianas termosensibles (esto es las psicrótrofas) no se destruyen por el agar fundido, lo que podría ocurrir, en cierta extensión con el método anterior, si la temperatura del agar es demasiado alta; segundo, todas las colonias crecen en la superficie del agar y pueden observarse y picarse fácilmente si fuera necesario, mientras que en el método de vertido en placa muchas colonias se desarrollan incrustadas en el agar, teniendo menor tamaño y siendo más difíciles de subcultivar. Con esta técnica de la gota en placa, también se emplea un medio de agar solidificado. Se utilizan pipetas especialmente calibradas que vierten 0,02 ml por gota. En la superficie de la placa se dejan caer cinco gotas separadas (o sea 0,1 ml) que se dejan secar antes de la incubación. Sólo deben con tarse las placas cuyas diluciones producen 20 colonias por gota.

Puesto que los métodos citados además de requerir bastante tiempo son caros en material, se ha desarrollado otro más rápido que utiliza menores cantidades, es el método de la «gotita de agar» (Sharpe y Kilsby, 1971). En esta técnica las diluciones se preparan con agar fundido y las colonias se desarrollan en las gotas solidificadas (0,1 ml) durante la incubación. El recuento de las colonias se facilita empleando un visor de proyección que amplía las gotitas unas diez veces aproximadamente. Otro método semiautomático, cada vez más popular, es el de la placa en espiral (Gilchrist et al, 1973) en el que una máquina vierte continuamente un volumen conocido de muestra en la superficie de una placa de agar que gira. La cantidad de muestra depositada disminuye a medida que el tubito dosificador se desplaza desde el centro a la periferia de la placa girante; de esta forma durante la incubación las colonias bacterianas se desarrollan siguiendo un trazo en espiral. El recuento puede realizarse manualmente empleando una red de contaje o mediante contadores de colonias basados en rayos láser, especialmente diseñados para su empleo con esta técnica. Comparaciones realizadas con métodos más tradicionales han demostrado que no hay diferencias significativas en los recuentos obtenidos (Jarvis et al., 1977).

A medida que los microorganismos se multiplican en un medio de crecimiento, acaecen diminutos cambios de impedancia que pueden medirse haciendo pasar por el medio una pequeña corriente eléctrica. A una concentración concreta de microorganismos tiene lugar un cambio marcado de impedancia y como es lógico, con una carga bacteriana inicial más alta esta concentración umbral se alcanza antes. Así puede estimarse el número de microorganismos inicialmente presentes en el alimento; para ello se registra el tiempo requerido (tiempo de detección) para alcanzar el umbral, empleando muestras del alimento diluidas en un medio de crecimiento. Se ha demostrado que hay una buena concordancia entre los recuentos viables convencionales y los tiempos de detección (Hardy et al., 1977). Además los tiempos requeridos para los análisis son normalmente de unas 5 horas lo que permite estimar rápidamente la calidad.

En ocasiones puede necesitarse obtener el número total de microorganismos (esto es, células viables y muertas) de nuestros alimentos como, por ejemplo, alimentos enlatados y leche pasterizada. En portaobjetos de vidrio se hacen extensiones de la muestra, generalmente diluida, que se tiñen con un colorante adecuado. Se cuenta el número total de células microbianas de un número dado de campos microscópicos y del recuento obtenido puede calcularse aproximadamente el número total de microorganismos por gramo de alimento.

El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias patógenas es impracticable en la mayoría de los laboratorios, bien porque estén inadecuadamente dotados, bien porque el tamaño de la muestra impediría su manejo convenientemente. Por ello se ha convertido en práctica corriente investigar en los alimentos la existencia de bacterias que indican la posibilidad de la presencia de las productoras de toxiinfecciones alimentarias o de otras patógenas. Por ello se les denomina «microorganismos indicadores» y se catalogan frecuentemente como de gran importancia al establecer la seguridad y calidad microbiológica de los alimentos. Las principales bacterias empleadas como indicadores son coliformes, enterococos y, más recientemente, enterobacteriáceas. En ocasiones resultan una buena guía los recuentos viables totales a 37º C, si bien su relación con la seguridad de los alimentos es más bien débil.

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales.

Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos – diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso.

Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales.

En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.

Los medios complejos, se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denomina caldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa – peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseina. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilizacion de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.

Un medio selectivo favorece el crecímiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes.

Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco común.  Los medios diferenciales se utilizan para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemolisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.

Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo – diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas).

A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán. Un medio de cultivo se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambien es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado.

En la rutina diaria del trabajo de microbiología de agua y alimentos, y reglamentadas por los principales Organismos de Control Internacionales (CODEX ALIMENTARIUS, ICMSF, AOAC) y Nacionales (CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO), se llevan a cabo las siguientes marchas de investigación y aislamiento de patógenos, de acuerdo a lo legislado como “Criterios Microbiológicos” para cada alimento en particular y que serán descriptas e ilustradas en los blogs que se renovarán a continuación.