martes, 10 de junio de 2014

GUÍA PRACTICA DEL LABORATORIO MICROBIOLOGICO DE AGUAS Y ALIMENTOS (PARTE 2)

Metabolismo bacteriano y factores que inciden en su normal desarrollo

Las bacterias que pueden presentarse en el agua de consumo y en los alimentos crudos y/o cocidos, son microorganismos de una organización celular simple y se encuentran solos o agrupados; constan de una pared rígida que además de otorgar una forma característica para cada familia bacteriana, le permitirá a las mismas colorearse o no con determinadas substancias que nos orientarán a priori sobre qué género de bacteria está contaminando la muestra. Dichos contaminantes, bajo condiciones favorables de pH, temperatura y nutrientes, desarrollan un crecimiento explosivo. Amplios grupos de microorganismos, pueden atacar a alimentos mono y disacáridos y además casi todos desarrollan en estrechos rangos de pH que van entre los 6,60 a los 7,50 como valores extremos promedio, excepto los mohos y levaduras que prácticamente abarcan la escala de 0 a 14.  Un alimento capaz de soportar el desarrollo de gérmenes tiene una composición microbiana constante, únicamente, cuando ha intervenido un factor externo (por ejemplo, congelación o deshidratación) o cuando se han agotado todos los elementos nutritivos (alcanzando una alteración completa) o, una vez que, la acumulación de productos metabólicos finales ha llegado a un nivel que determina la inhibición de todo crecimiento por ejemplo, fermentación o adobado).
Una población uniforme, después de alcanzada su estabilización, comienza a decrecer. Un estudiante de Microbiología diría que esta descripción corresponde exactamente al perfil de la curva de crecimiento bacteriano.
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Hasta que se llega a la etapa de estabilización, la composición cualitativa y cuantitativa de la microflora está cambiando constantemente. Cada alimento tiene, en un momento dado, un perfil microbiano característico, comenzando por la "flora inicial", correspondiente a la recolección o sacrificio, que va aumentando a lo largo del transporte, elaboración y almacenamiento. El microambiente específico de cada alimento, en particular y, las acciones estimuladoras o inhibidoras, que ejercen unos microorganismos sobre otros, influirán en el resultado final.  Existen ciertas condiciones que favorecen el desarrollo de microfloras específicas e inhiben la presencia de otras; estas condiciones se traducen en factores intrínsecos, de elaboración y extrínsecos. Las bacterias responsables de las ETAs (Enfermedades Transmitidas por los Alimentos) tienen una temperatura óptima de crecimiento de 37º C.  Pese a todo, pueden crecer a una velocidad considerable en un rango de temperatura que se halla entre los 5º C Y 65º C. Fuera de este rango su capacidad reproductora se ve muy disminuida.  A 100º C (ebullición) las bacterias comienzan a morir y por debajo de 5º C (refrigeración) su crecimiento es más lento; a los 0° C (congelación) quedan en estado latente pero no mueren.

Los psicrótrofos: crecen a Tª de refrigeración (- 5° C) y a óptimas de 20 – 30° C (Cl. botulinum).
Los psicrófilos crecen a Tª de refrigeración con óptimas de 10 – 15° C (Psicrobacter sp).
Los mesófilos crecen entre los 30 y 40ºC (Enterobacterias).
Los termótrofos crecen entre 42 y 50° C (Escherichia coli).
Los termófilos crecen entre 50 y 90° C (Bacilo estearotermófilo).

Las bacterias como todos los seres vivos, necesitan alimentarse para poder desarrollarse. Prefieren alimentos con un alto contenido de proteínas y humedad tales como carnes rojas, pollos, pescados o productos lácteos.  La humedad del agua en algunos alimentos va de fuera a dentro o al revés. Si la humedad relativa atmosférica es igual a la del alimento se conserva inalterado. Si la humedad relativa del alimento es < que la humedad relativa atmosférica el alimento se seca (EJ: Jamón de York o Jamón cocido). Si la humedad relativa atmosférica es > que la humedad relativa del alimento: se humedece el alimento y pueden crecen hongos (galletas, pan).  Para preservar la contaminación de los alimentos; guardar bajo condiciones ambientales restrictivas. Cuando se almacenan bajo condiciones restrictivas se retrasa el deterioro del alimento al reducirse el crecimiento microbiano. Los factores intrínsecos son inherentes a los alimentos e influyen en el crecimiento microbiano. Corresponden a características químicas, físicas y bioquímicas (nutrientes, factores antimicrobianos naturales, pH, Aw y Eh). Sus efectos combinados determinaran la selección de la porción de la flora inicial capaz de sobrevivir o crecer; los microorganismos que no pueden competir en ese ambiente, son eliminados gradualmente. Por ejemplo, la mayor parte de las bacterias gram-negativas, que originalmente se encuentran en gran cantidad en las plantaciones, no sobreviven en los frutos cítricos, debido al pH claramente desfavorable. Por lo tanto, su alteración está producida por mohos, levaduras o microorganismos gram – positivos, que únicamente se encontraban, en la flora inicial, en proporciones menores.
Los nutrientes se han de encontrar en forma que puedan ser utilizables o degradables por los microorganismos. Algunas estructuras son resistentes al ataque microbiano y solamente pueden ser degradadas por microorganismos con enzimas específicos. La mayoría de los microorganismos alterativos no son exigentes en cuanto a sus nutrientes. Se ha venido considerando que, la alteración de los alimentos ricos en proteínas es el resultado del ataque de los enzimas bacterianos proteolíticos, que liberan aminas y péptidos de bajo peso molecular; pero actualmente se sabe que, el desarrollo microbiano en carne conservada en condiciones aeróbicas, no da lugar a una descomposición proteica significativa, hasta que no se alcanza un avanzado estado de alteración (Dainty y col., 1975).

El crecimiento bacteriano inicial se produce a expensas de la glucosa y ribosa y, continúa utilizando los lactatos y aminoácidos (Gill, 1976). Únicamente, ciertos grupos de microorganismos especiales tienen un potencial enzimático suficiente para atacar estructuras biológicas complejas y dar lugar a alteraciones. Por ejemplo, los estados de degradación iniciales de muchos tejidos vegetales, sólo pueden ser producidos por microorganismos que segregan celulasas o pectinasas. Estos enzimas despolimerizan los polisacáridos de la pared celular y liberan compuestos metabolizables de peso molecular bajo, que pueden ser utilizados por otros microorganismos.
Ciertas proteínas (queratina o elastina) son muy resistentes a la degradación por enzimas microbianos. Otras, como el colágeno, son descompuestas por la colagenasa, que sólo la producen muy pocos microorganismos (Pseudomonas sp, Clostridium perfringens y otros clostridios patógenos). Las proteínas y péptidos solubles se degradan mucho más fácilmente. Como resultado de este proceso de degradación se puede llegar a establecer un patrón particular de aminoácidos libres (Mifier y Kandler, 1967).
Una vez que las proteínas han sido fragmentadas por la flora proteolítica, en elementos de peso molecular bajo, estos son fácilmente utilizados por la flora restante. Algunas especies liberan aminoácidos, que pueden ser asimilados por otros microorganismos, de tal modo que, llegan a establecerse asociaciones de dependencia. Otros producen péptidos de carácter estimulante.
Por ejemplo, Streptococus thermophilus da lugar, en el yogur, a péptidos, que utiliza Lactobacillus bulgaricus. Muchos microorganismos alterativos (Pseudomonas y Bacillus sp), así como la mayor parte de los mohos y algunas levaduras y enterobacterias producen enzimas lipolíticas, que hidrolizan las grasas (Mossel y Harrewijn, 1970; Mossel, 1971).
La proteólisis y glucólisis son actividades metabólicas esenciales de muchos organismos alterativos, mientras que, la lipólisis es menos frecuente. Existen dos razones que avalan esta idea. Primera, la proteólisis y glucólisis se llevan a cabo mucho más rápidamente, porque los sustratos de proteínas y carbohidratos son, casi siempre, solubles y, por lo tanto, más fácilmente accesibles a los enzimas microbianos intra y extracelulares. Segunda, las grasas son relativamente insolubles, por lo que las porciones directamente accesibles a los enzimas extracelulares de los microorganismos alterativos son generalmente muy pequeñas, estando inicialmente limitadas a la superficie de la monocapa de las partículas grasas.  En algunas emulsiones alimentarias "agua en aceite", la distribución de los microorganismos en las gotitas grasas aisladas está hecha de tal forma que, la mayor parte del lípido no es accesible a los enzimas microbianos.

De hecho, el deterioro oxidativo de las grasas está originado principalmente por factores físicos y químicos, siendo raro el enranciamiento microbiano. No obstante, la lipólisis lenta, efectuada por los microorganismos, contribuye a la obtención de los típicos sabores de ciertos quesos (Roquefort, Gorgonzola) y de algunos productos cárnicos desecados y fermentados de forma natural, como el salame. La actividad lipásica es importante, en relación con las modificaciones del sabor, sólo como una primera etapa de una serie de reacciones. No existe correlación entre la producción de lipasas y la actividad oxidativa de los microorganismos (Alford y col., 1971).  El contenido vitamínico de los alimentos no constituye un factor importante que pueda influir en la presentación de alteraciones, por lo que la pérdida de vitaminas en los alimentos, raramente, evita o retrasa su deterioro. No obstante, existen excepciones. Así, en los huevos los mecanismos antimicrobianos incluyen la unión de la biotina a la avidina, que disminuye la capacidad alterativa de los microorganismos (Board, 1969).

Todos los alimentos contienen minerales en cantidades excesivas, en relación con los que los microorganismos requieren para su crecimiento. En sustratos totalmente exentos de minerales no es posible el crecimiento de microorganismos y los zumos de frutas, completamente desmineralizados por intercambio iónico, son más resistentes a las levaduras que los productos no tratados.
Ciertos alimentos contienen constituyentes microbianos; este tema ha sido revisado por Mossel e Ingram (1955) y Mossel (1971,1975). Estos constituyentes se han encontrado en algunos tejidos vegetales, como especias (Fuchs, 1958), cebollas, ajos (Wei y col., 1967; Drechsel, 1965), berros y perejil, así como frutas (uvas).  Las frambuesas contienen ácido salicílico, las bayas del fresno, ácido sórbico, y los frutos cítricos, aceites antibacterianos. Existen actividades antimicrobianas en alimentos de origen animal, sobre todo en la sangre (complemento, properdina, lisozima, histona, protamina y hematina). El calostro, leche, saliva, leucocitos y algunos otros fluidos y tejidos tienen un sistema antimicrobiano eficaz, en el que la peroxidasa ("lactoperoxidasa" de la leche) cataliza la peroxidación de sustancias de bajo peso molecular (como el tiocianato) para formar productos que inactivan a los microorganismos. Los huevos de gallina contienen lisozima, que lisa ciertas clases de bacterias.
El crecimiento y multiplicación de los microorganismos están influidos por la estructura o estado físico de los alimentos; por ejemplo, el estado líquido o congelado del agua tisular, la distribución de la fase acuosa de las emulsiones y la presencia de barreras biológicas (cáscara y membranas de los huevos, escamas del pescado y piel de las aves).

La actividad antimicrobiana de los enzimas tisulares se reduce o, incluso se destruye, por tratamiento térmico. La congelación puede liberar importantes cantidades de lisozima de los tejidos animales e inhibir el crecimiento de los microorganismos, utilizados para detectar residuos de antibióticos u otras sustancias innibidoras, en la inspección de carnes. En consecuencia, se pueden obtener resultados positivos falsos (Heinert y col., 1976). Frecuentemente, se sobrevalora la importancia de muchas actividades antimicrobianas de los alimentos.

En la mayor parte de los casos, sus efectos quedan limitados a determinados grupos de microorganismos. Algunos componentes pueden anular los efectos de otros. En este sentido, ciertos cationes divalentes contrarrestan los efectos inhibidores de los ácidos grasos de cadena larga (Galbraith y col., 1971).

a. FACTORES DE ELABORACIÓN

Todos los factores que influyen en la colonización, supervivencia y crecimiento microbiano durante la preparación de los alimentos, se denominan factores de elaboración. Estos factores pueden inhibir o, incluso destruir, parte o la totalidad de la población. Por otro lado, los componentes individuales de la flora están, en ciertos aspectos, de tal modo favorecido que producen cambios en el perfil microbiológico.

b. FACTORES EXTRÍNSECOS

Están representados por factores ambientales, como temperatura de almacenamiento, presión de vapor del agua y presiones parciales de los gases de almacenamiento, que seleccionan una flora particular.

c. EFECTOS COMBINADOS

El desarrollo microbiano determina la alteración o la enfermedad de origen alimentario que es, a su vez, una combinación de factores intrínsecos, de elaboración y extrínsecos, que son independientes. En la Tabla expuesta a continuación, se señalan los niveles más bajos de actividad de agua, temperatura y pH compatibles con el crecimiento de los principales microorganismos productores de enfermedades transmitidas por alimentos. Si dos de estos factores son óptimos, el crecimiento se producirá dentro de los límites del tercero; aunque éstos sean más estrechos cuando los otros dos factores no son los más idóneos.
El desarrollo del Clostridium botulinum tipo A, a pH 7 y 37ºC, tiene lugar a aw de 0,94, mientras que a pH 5,3, el límite de aw para que haya crecimiento es de 0,99 (Baird – Parker, 1971). Las salmonelas proliferan a pH 5,8 y a aw de 0,971, pero si el pH es de 5, el valor de aw tiene que ser de 0,986 o superior. Para Staphylococcus aureus se ha señalado una interdependencia similar (Genigeorgis y Sadler, 1966; Genigeorgis y col., 1971a).


Aspergillus glaucus, a pH 5 es capaz de multiplizarse a aw, de 0,73, pero a pH 3 precisa valores de aw de 0,77 o superiores (Lubienieckivon Schelhorn, 1972-1974). Generalmente, la inhibición está causada por una combinación de efectos desfavorables. La combinación de pH, ClNa (aw) y NO2Na, que incide el crecimiento de S. aureus (cepa productora de enterotoxina A) a 35 y 15ºC, y la acción del calor, que a 65ºC determina una supervivencia del 0,1 % (Bean y Roberts, 1974) pueden ser ilustraciones del efecto inhibitorio adicional del calor, cuando se combina con una incubación a temperatura reducida. Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y E. coli son más sensibles al NO2Na, en presencia de ClNa a 10ºC, que a 15 – 35ºC (Albalas y Roberts, 1977).  Con C botulinum tipos A y B (inóculo de esporos) incubados durante 6 meses, se observa un incremento similar de la sensibilidad frente a NO2Na, en presencia de CINa (Roberts y col., 1976). A 20 – 25ºC el crecimiento y la producción de toxina era similar, a 17,5ºC menos evidente y, a 15ºC no existía crecimiento durante 2 – 3 meses. En todas las combinaciones de ClNa y NO2Na, el desarrollo continuaba aumentando hasta los 6 meses.



d. pH Y ACIDEZ

En estado natural, la mayoría de los alimentos, como carnes, pescados y productos vegetales, son ligerarnente ácidos. La mayor parte de las frutas son bastante ácidas y solo algunos alimentos, como la clara de huevo por ejemplo, son alcalinos. Para preservar los alimentos, durante miles de años se ha venido aumentando su acidez, bien de manera natural, por fermentación, o artificial, por adición de ácidos débiles, con lo que se consigue inhibir la proliferación microbiana. La acidez puede ser un factor básico en la preservación. como en el caso de algunos alimentos fermentados tales como el yogur, la col fermentada o los pepinillos en vinagre, o tener un papel auxiliar, cuyo efecto se combina con el de otros factores tales como conservadores químicos, calor o actividad de agua (aw).
La concentración de iones de hidrógeno está representada en la definición de pH de la forma que sigue:
pH = -1og10 [H+] ó pH = 1og10(1/[H+])
Así pues, el pH es el logaritmo negativo de la concentración de protones o iones hidrógeno. En alimentos, las sustancias ácidas que interesan son casi siempre ácidos débiles (HA) que se disocian dando lugar a H+ y aw. En equilibrio, la relación entre [H+] [A-] y [HA] es una constante (Ka), siendo Ka = [H+] [A-] / [HA]. Lo que también se puede expresar como
[H+] =Ka [HA] / [A-]
y obteniendo el logaritmo negativo de ambos términos de la ecuación,
-log H+ = -log Ka -log[HA] + Iog [A-]
ó
pH = pKa + log [A-]/[HA]
Si [A-]y [HA] son iguales, el logaritmo de su cociente es cero, y el pH = pKa. En otras palabras, pKa = pH, cuando la concentración del ácido disociado es igual a la del ácido no disociado. En los manuales de física y química, están tabulados los valores de Ka y pKa de diversos ácidos. Conociendo la concentración del ácido, el pH y el pKa ó Ka, se puede calcular la cantidad de ácido no disociado presente en una solución.
Los ácidos fuertes tienen valores de pKa muy bajos, esto es, están casi totalmente disociados cuando estan en solución. Esto supone que aportan una [H+] proporcionalmente mayor que un ácido débil. Por ejemplo, el pH (a 25ºC) de una solución 0,1 N de HCl es 1,08, mientras que el de una solución también 0,1 N de ácido acético es 2,87. El título de acidez es la cantidad de álcali standard (habitualmente 0,1 N NaOH) que se necesita para neutralizar una solución ácida. Mide la cantidad de ion hidrógeno libre y la de ion hidrógeno liberado a partir del ácido no disociado durante la titulación.



El pH de un alimento es uno de los principales factores que determinan la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos durante el procesado, el almacenaje y la distribución. Como el efecto de algunos otros factores, de los que se habla en este volumen, depende en parte del pH y es a veces difícil separar el efecto del pH per se y el de otros factores influidos por el pH. Así por ejemplo, los microorganismos se ven afectados por el nivel de iones H+ libres (o sea, el pH per se) y además, por la concentración de ácido débil no disociado, la cual a su vez depende del pH. Los aniones de algunos ácidos débiles (del ácido acético o láctico, por ejemplo) son metabolizados dentro de la célula bacteriana, liberando H+ que acidifica el interior de la célula hasta alcanzar niveles inhibitorios. Otros aniones no son metabolizados y por tanto no acidifican el interior de la célula.  El pH se determina normalmente con un pHmetro electrónico, obteniendo una precisión de aproximadamente ± 0,01 unidades de pH dentro del rango de 0 a 14. El pHmetro puede venir equipado con un electrodo de membrana de vidrio y otro electrodo de referencia, o bien con un único electrodo combinado, lo que es cada vez más frecuente. El electrodo de referencia suele ser de calomelano, con puente salino de solución saturada de cloruro potásico. Se ha hecho un estudio comparado de los diversos métodos aplicables para determinar mediante pHmetro el pH de alimentos de humedad intermedia (Acott y Labuza, 1975a).


Todos estos métodos vienen a dar resultados sinulares. El de la AOAC, que utiliza un electrodo de lectura directa, resultó en el estudio comparativo ser tan fiable como cualquier otro, siempre que el alimento fuera lo suficientemente plástico como para permitir el contacto con el extremo sensor del electrodo. Si el alimento es más bien seco, la técnica del gráfico de Gran resulta ser la más apropiada; la capacidad tamponadora del alimento puede sin embargo afectar a la medida. Para consulta de los métodos standard para la medición del pH de alimentos concretos, úsese la 128 edición del "Official Methods of Analysis of the Association of the Official Analytical Chemists" (Horwitz, 1975). Las características físicas del producto determinan cual ha de ser en cada caso el procedimiento más adecuado para preparar la muestra y medir su pH. Para alimentos líquidos o semilíquidos de consistencia homogénea, basta con sumergir en la muestra el extremo del electrodo y asegurarse de que el contacto sea completo.
Los alimentos que contienen partículas sólidas han de ser homogeneizados antes de tomar la muestra, para poder medir el pH global. Algunos alimentos no son homogéneos y presentan gradientes de pH entre la superficie y el centro de la pieza o partícula (es el caso, por ejemplo, de algunos productos vegetales durante el proceso de encurtido). Las diferencias de pH en distintos puntos de la muestra son reflejo de su naturaleza y tamallo.


Para medir el pH de una superficie húmeda (como la de filetes de carne o pescado, por ejemplo) basta con aplicar los dos electrodos con suficiente presión como para obtener una lectura en el pHmetro; la medida corresponde al pH existente en la superficie del electrodo de vidrio, mientras que el electrodo de calomelano sirve sólo para establecer contacto eléctrico (Elliott, 1947).  En determinadas circunstancias, por ejemplo, cuando se trata de alimentos muy ácidos o fuertemente tamponados, el título de la acidez puede ser más útil que el empleo del pHmetro. Una proporción sustancial del ácido débil en solución se encuentra en forma no disociada, por lo que no contribuye directamente al pH, que sólo indica concentración de protones, no concentración total de ácido.  Como la acción bacteriostática de los ácidos débiles depende básicamente de la concentración de molécula no disociada, es necesario primero estimar el pH del alimento y después, valorar la concentración total de ácido, lo que normalmente se hace mediante titulación con 0,1 N NaOH. Durante la titulación, la dilución del ácido y el drenaje de iones H+ provocan la disociación gradual del ácido inicialmente no disociado, liberando los iones H+ restantes, que pueden así ser titulados.
Muchos microorganismos pueden crecer dentro de un amplio rango de pH. Cabría suponer pues, que estas células disponen de métodos eficaces para estabilizar su pH interno. Sin embargo, se ha comprobado que el pH interior puede verse considerablemente afectado por el pH del medio exterior. Se ha estudiado esta cuestión a base de seguir el paso, a través de la membrana celular, de un ácido débil, la 5,5dimetil-2,4-oxazolidindiona (DMO).  En el rango de pH entre 5 y 7, el pH interno de Escherichia coli resultó ser más alcalino que el del medio exterior y por encima de pH 7, más ácido (Kashket y Wong, 1969). 

Hay una serie de ácidos débiles que a pH igual o inferior a su valor de pKa, han resultado ser potentes inhibidores del transporte de aminoácidos en Penicillium chrysogenum. Entre los compuestos que han mostrado este efecto, están el ácido sórbico, el benzoico y el propiónico; se ha sugerido que la forma no disociada de estos ácidos débiles podría difundirse libremente a través de la membrana celular, e ionizarse dentro de la célula, dando lugar a protones que acidificasen el medio interno de este organismo, que es normalmente alcalino (Hunter y Segel, 1973). Efectos parecidos se han observado en diversos organismos y la eficacia práctica como conservadores de distintos ácidos no disociados, se conoce desde hace muchos años (Ingram y col., 1956).
Algunos experimentos han dado pistas sobre lo que podia ser el mecanismo por el que actúan los ácidos débiles. Freesey y Col (l973) por ejemplo,determinaron en células microbianas la relación existente entre el pH externo y el interno, empleando ácidos débiles de carácter lipofilico como conservadores; su conclusión fue que es la relación entre la tasa de pérdida de protones internos y la de rechazo de protones externos, por parte de la célula, lo que determina la magnitud del efecto inhibitorio del entorno.
Existen dos tipos de conservadores ácidos:

1. Los ácidos fuertes (como el clorhídrico o el fosfórico), cuyo efecto consiste en bajar considerablemente el pH, proporcionando una concentración externa de protones muy elevada, que determina la acidificación del medio interno celular. Tales condiciones son normalmente inaceptables en alimentos, pero permisibles en bebidas carbónicas, en las que se emplea el ácido fosfórico como acidulante.
2. Los ácidos débiles lipofílicos, que provocan la entrada de protones a través de la membrana celular, acidificando el interior de la célula e inhibiendo el transporte de nutrientes.



Algunos ácidos se disocian dando lugar a aniones (lactato o citrato, por ejemplo) que la célula es capaz de transportar y cuya presencia por tanto no inhibe el metabolismo energético. Otros ácidos, como el acético o el fórmico, son eficaces conservadores debido a que no sólo son buenos conductores de protones, sino que además pueden dar lugar a concentraciones intracelulares de sus aniones que ejercen acción inhibitoria. Los iones potenciadores de ácidos, tales como el  sulfito o el nitrito (las sales de ácidos minerales débiles), que resultan altamente inhibitorios a pH bajo.  Las células de diferentes especies microbianas muestran muy distinta tolerancia a la acidificación interna o a la acumulación de aniones y sus membranas presentan distintas características en cuanto a permeabilidad de ácidos lipofílicos.  A partir de una flora mixta, la acidez puede actuar como agente selector de un componente de la población inicial que sea particularmente tolerante. Las levaduras y los lactobacilos resultan a menudo seleccionados por efecto de los pHs bajos.

e. ACTIVIDAD DE AGUA REDUCIDA

Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (Aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentración de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extracción del agua o mediante la adición de solutos.
Algunas moléculas del agua se orientan en tomo a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por los componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en una forma que es menos reactiva.  La deshidratación es un método de conservación de los alimentos basado en la reducción de la aw,lo que se consigue eliminando el agua de los productos. Durante el curado y salazonado, así como en el almíbar y otros alimentos azucarados son los solutos los que, al ser añadidos, descienden la aw.  Un pequeño descenso de la aw es a menudo suficiente para evitar la alteración de los alimentos siempre que esta reducción sea potenciada por otros agentes tal como ocurre con los nitritos en muchas carnes curadas y con los componentes del humo en los alimentos ahumados, salazonados y desecados.
La aw de un alimento o solución se define como la relación entre la presión de vapor del agua del alimento (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura.

aw = p/po

A medida que una solución se concentra. la presión de vapor disminuye y la aw va descendiendo a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares o fuerzas de adsorción). La aw está relacionada con el punto de congelación y con el de ebullición así como con la humedad relativa en equilibrio (ERH) y la presión osmótica.  Los primeros estudios sobre la respuesta de los microorganismos frente a la humedad se describieron en términos de ERH o presión osmótica. La ERH, como la aw, es la relación entre la presión de vapor de la solución y la del agua pura pero expresadas en porcentaje. Por ello,

ERR (%) = aw · 100

La ERH se refiere estrictamente a la atmósfera en equilibrio con una solución o alimento y constituye una expresión menos apropiada que la aw como forma de medir el agua disponible.
Sin embargo, los solutos nunca son ideales. De una parte, las interacciones entre las moléculas pueden reducir el número efectivo de partículas en la solución, mientras que de otra, la disociación puede incrementar realmente dicho número.  Tales factores conducen a desviaciones del sistema ideal que son realmente grandes para los no electrolitos a concentraciones superiores a 1 molal y para los electrolitos a cualquier concentración.
Las concentraciones se expresan en grados Baumé, Salometer y Brix que son los términos más ampliamente utilizados en la Industria Alimentaria.  Los datos ofrecidos anteriormente permiten predecir la aw de una solución sencilla de composición conocida pero la relación entre la composición de un alimento y su aw es mucho más compleja. Para conocer estas relaciones lo habitual es determinar los valores de la aw del alimento a diferentes concentraciones de agua, los que se representan gráficamente con el fin de obtener la isoterma de sorción de agua. 
Los factores que reducen la presión de vapor de agua en los alimentos y, por tanto, la aw son los siguientes: la adsorción de las moléculas de agua a las superficies, las fuerzas capilares y las sustancias disueltas que se han mencionado anteriormente. Normalmente se acepta que la primera subida de la isoterma representa la adsorción del agua que forma una monocapa de moléculas en los lugares de adsorción del producto sólido. Al anadir más agua, la isoterma aumenta rápidamente de nuevo a medida que los solutos se disuelven y se llenan los espacios capilares. Estos fenómenos se solapan y algunos, realmente, pueden no estar representados en la isoterma. En estos casos puede no evidenciarse la monocapa en los alimentos que contengan poco material estructural al mismo tiempo que las fuerzas capilares pueden tener poca influencia. Para muchos alimentos, la isoterma obtenida por adsorción de agua a un producto seco difiere de la hallada secando un alimento húmedo.
Este efecto se denomina histéresis y la parte divergente de las isotermas se le llama "espacio" de histéresis.
En la práctica, la mayoría de los alimentos con una baja aw se preparan por desorción del agua, es decir, deshidratándolos. Por ello, la isoterma de desorción es la más importante y la histéresis no presenta problema alguno. Sin embargo, la situación puede ser más complicada cuando se formulan ciertos alimentos, los que poseen un grado de humedad intermedio (aw = 0,60 - 0,90) en los que se mezclan ingredientes con valores de aw distintos. En los alimentos que muestran un marcado grado de histéresis a altos niveles de aw, los microorganismos pueden crecer más rápidamente, a iguales aw, en los sistemas ajustados por desorción que en aquellos preparados por un proceso de adsorción (Acott y Labuza, 1975b).
La actividad de agua depende de la temperatura dado que ésta influye también sobre la presión de vapor de agua de las soluciones pero el efecto es pequeño con la mayoría de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas. En tales casos, las cantidades de algunas sustancias de la solución, y por tanto la aw, pueden variar marcadamente con la temperatura. A temperaturas inferiores a las del punto de congelación de una solución o alimento, la presión de vapor del agua líquida disminuye al descender la temperatura. La aw de una solución o alimento congelados es función de la temperatura presentando un valor de 0,953 a -5ºC; de 0,907 a -10ºC; de 0,864 a -15ºC y de 0,823 a -20ºC. Scott (1962) ha estudiado los límites del crecimiento microbiano en un medio congelado en relación con la temperatura y la aw.
La determinación de la aw se realiza habitualmente en el laboratorio mediante higrómetros eléctricos o de cabello que se encuentran en el mercado o por interpolación gráfica. En este último método, las muestras del alimento se mantienen a temperatura constante en envases (preferentemente evacuados) que contienen soluciones (con frecuencia saturadas) de aw conocidas.
Las variaciones de peso sufridas por las muestras en un período de varias horas se representan gráficamente respecto a la aw de la solución control. La aw a la que la gráfica indica que no ha habido variación en el peso es la aw del alimento.
  
f. TEMPERATURA

El hombre ha aprendido a lo largo de los siglos, por vía empírica,a explotar las temperaturas extremas para la conservación de sus alimentos. Observó que enfriándolos se retrasaba su alteración; que manteniéndolos en estado congelado se conservaban durante largos periodos de tiempo; que el calentamiento eliminaba los agentes de la alteración de origen microbiano y que, si se evitaba la recontaminación mediante un envasado adecuado, los alimentos térmicamente tratados podían con servarse incluso a la temperatura ambiente.
Del mismo modo, averiguó que algunos alimentos, mantenidos a la temperatura ambiente, sufren modificaciones de sus propiedades organolépticas, pero siguen siendo aptos para el consumo y se tornan considerablemente más estables. Así se fue desarrollando una amplia variedad de alimentos fermentados, muchos de ellos asociados en su origen a una determinada raza y a los alimentos frescos localmente disponibles.
La sociedad moderna consume cientos de productos fermentados que, pese a que un buen número de ellos se han visto favorecidos por la aplicación de los conocimientos científicos, recientemente descubiertos, siguen siendo esencialmente idénticos a los que se consumían hace varias generaciones.
Las fermentaciones generalmente implicadas son la láctica y la alcohólica, o una combinación de ambas. Si el alimento original contiene un azúcar fermentescible y se encuentra moderadamente salado es probable que se produzca una fermentación láctica Si su sabor es ácido,lo esperable es una fermentación alcohólica.



En cualquier caso, para conseguir las características deseadas en el producto fermentado de que se trate, resulta esencial el control de la temperatura, generalmente un ambiente frío.


A lo largo de milenios de la historia de la humanidad, sólo las dos o tres últimas generaciones han sido capaces de capitalizar para la conservación y las fermentaciones de los alimentos los principios científicos en que estos procesos se basan. El control y la manipulación de la temperatura se encuentran entre los factores más críticos precisos para el logro de un suministro alimenticio que reuna las propiedades sanitarias organolépticas etc. correctas. En este capítulo describiremos los principios científicos relacionados con la explotación de la temperatura en el control de los microorganismos que de ordinario pueden encontrarse en los alimentos consumidos por el hombre. Probablemente sea la temperatura el más importante de los factores ambientales que afectan a la viabilidad y el desarrollo microbianos. Aunque el crecimiento microbiano es posible entre alrededor de -8 y hasta +90º C, el rango de temperatura que permite el desarrollo de un determinado microorganismo rara vez excede de los 37º C. Dentro de este rango, la temperatura afecta a la longitud de la fase de latencia, a la velocidad de crecimiento, al número final de células, a las necesidades nutritivas y a la composición química y enzimática de las células. Cualquier temperatura por encima de la máxima de crecimiento de un determinado microorganismo resulta letal para el mismo, y cuanto más elevada sea la temperatura en cuestión tanto más rápida será la pérdida de viabilidad. Sin embargo, la letalidad de cualquier exposición a una determinada temperatura por encima de la máxima de crecimiento depende de la termorresistencia que es fundamentalmente una característica del microorganismo considerado.

Los microorganismos sobreviven a temperaturas inferiores a la mínima de crecimiento. Los efectos letales de la refrigeración y la congelación dependen del germen considerado, del microambiente y de las condiciones de tiempo y temperatura de almacenamiento. Algunos microorganismos permanecen viables durante largos periodos de tiempo si se mantienen congelados a temperaturas suficientemente bajas. Tras un periodo de ajuste o adaptación al ambiente (fase de latencia) comienza el crecimiento que se acelera hasta alcanzar una etapa de multiplicación rápida y constante, de crecimiento exponencial, denominada fase logarítmica o exponencial. La deplección de nutrientes y el acúmulo de metabolitos tóxicos termina frenando la velocidad de crecimiento hasta que alcanza un punto en el que muertes y divisiones celulares se igualan, permaneciendo así la población constante durante un periodo al que se conoce con el nombre de fase estacionaria. A esta fase en la que la población es máxima, sigue otra en la que va progresivamente decreciendo a causa de las muertes celulares.
La influencia de la temperatura sobre la actividad microbiana es más acusada en los alimentos húmedos, es decir a actividades de agua (aw) superiores a 0,85. La mayor parte de las bacterias son incapaces de seguir creciendo a actividades de agua inferiores. La Figura de abajo, ilustra las relaciones entre temperatura y tiempos de duplicación para dos microorganismos, un psicrotrófico y un mesófilo típicos. Tres efectos son fácilmente discernibles. A medida que la temperatura aumenta el crecimiento se acelera, es decir, decrece el tiempo de generación o duplicación.

A las temperaturas más elevadas, hay un rango en el que la velocidad de crecimiento, tiempo de generación, se mantiene relativamente estable (óptimo de crecimiento); este rango se halla en torno a 20 – 30º C para los psicrótrofos y 35 – 45° C para los mesófilos. A temperaturas sólo ligeramente superiores a las que son precisas para un crecimiento óptimo se da una inhibición del mismo. Las bacterias termófilas responden de un modo similar, pero su gráfica de crecimiento se encuentra sustancialmente desplazada hacia la derecha.

La naturaleza de la respuesta a cualquier temperatura dada se ve profundamente afectada por el tiempo de exposición a la misma. El crecimiento en un ambiente confinado, incluso a la temperatura óptima, cesa llegado un momento determinado a causa del gradual agotamiento de nutrientes.
En atención a sus rangos de temperatura de crecimiento, pueden distinguirse cuatro grupos fisiológicos fundamentales de bacterias: termófilas, mesófilas, psicrófilas y psicrotrofas. Los microorganismos mesófilos, muchos de origen humano o animal incluyendo los patógenos y numerosos tipos de los que alteran los alimentos prefieren temperaturas moderadas; ofrecen un óptimo que generalmente se encuentra entre los 30 y 45º C y una temperatura mínima de crecimiento que suele hallarse entre 5 y 10º C.
En un medio favorable, el tiempo de generación de muchos mesófilos a la temperatura óptima es de 0,5 horas, o aún menos. En los termófilos la totalidad de la gráfica que relaciona el crecimiento con la temperatura se halla desplazada hacia el rango de temperatura más alto. La temperatura para un crecimiento óptimo suele hallarse entre 55 y 65º C y en algunos casos es de hasta 75 – 90º C; la mínima se encuentra hacia los 35º C.

Todavía persiste cierta confusión con respecto al término psicrófilo. Utilizando los mismos criterios que nos han servido para definir los microorganismos mesófilos y termófilos, es lógico definir los psicrófilos en términos de su temperatura óptima de crecimiento, que debe ser claramente distinta de las de los dos citados grupos. Muchos autores, sin embargo, han clasificado como psicrófilos a todos aquellos microorganismos que son capaces de crecer a 0º C, sin tener en cuenta cual sea su temperatura óptima.

Otros distinguen a los microorganismos que toleran las bajas temperaturas en psicrófilos obligados, con óptimos inferiores a 20º C y psicrófilos facultativos con temperaturas óptimas más altas (Ingraham y Stokes, 1959). Morita (1975) reclama más consistencia en la definición que estima debe estar basada en la temperatura óptima; así denomina psicrófilos a los microorganismos que tienen una temperatura óptima de crecimiento alrededor de, o inferior a 15ºC y una máxima de alrededor de 20ºC,o menos.
Los auténticos psicrófilos abundan en los ambientes fríos más de lo que al comienzo se pensaba, especialmente en aquellos lugares en los que se mantiene constantemente una temperatura baja. De hecho el ambiente predominante de la biosfera es frío, dado que las regiones polares y los oceanos (95 % en volumen por debajo de 5ºC) representan el 14 y el 71 % de la superficie del planeta, respectivamente (Morita, 1975). Al aislar psicrófilos es preciso cuidar de un modo especial de evitar la exposición a temperaturas superiores a 10ºC. Al olvido o al desconocimiento de este hecho se deben pasados fallos en la detección de un gran número de psicrófilos. En la Tecnología de los Alimentos los microorganismos psicrófilos son menos importantes que los psicrotrofos, en virtud de su mayor sensibilidad a las temperaturas elevadas. Los auténticos psicrófilos son generalmente de origen marino siendo en este hábitat en el que mayor interés cobran y comprenden solo unos pocos géneros.

A los microorganismos capaces de crecer en las proximidades de 0º C, pero que no reunen los requisitos de temperaturas óptima y máxima para su clarificación como psicrófilos se les conoce como psicrótrofos (Eddy, 1960). Como crecen mejor a temperaturas moderadas, pueden considerarse como un subgrupo de los mesófilos capaz de desarrollarse a temperaturas inferiores a la mínima tolerada por la mayoría de los mesófilos. Entre los psicrótrofos se incluyen bacterias Gram positivas y Gram negativas; aeróbicas, anaeróbicas, y anaeróbicas facultativas; carentes y provistas de movilidad; esporuladas y no esporuladas. El grupo comprende numerosas especies pertenecientes a no menos de 27 géneros. También se encuentran cepas psicrótrofas de levaduras y mohos pertenecientes a géneros tan importantes como Penicillium y Aspergillus.
Temperaturas de refrigeración son aquellas próximas, pero superiores, al punto de congelación de los alimentos, habitualmente se consideran como tales las incluidas en el rango - 1 +7ºC. El efecto de la refrigeración sobre la microflora de un determinado alimento depende de la temperatura y el tiempo de almacenamiento, así como de las características fisiológicas de los microorganismos implicados. A medida que la temperatura desciende por debajo del óptimo, el crecimiento se hace más lento y finalmente se detiene. En el rango próximo a la temperatura de crecimiento, aumenta rapidamente la fase de latencia, tanto más cuanto más baja sea la temperatura, aproximándose finalmente a infinito. En el Ciadosprium herbanm, un hongo extremadamente tolerante a las bajas temperaturas, la fase de latencia oscila entre un día a la temperatura ambiente y 18 días a -5º C.
Se han citado periodos de latencia de hasta 414 días, pero es dudoso que a lo largo de un periodo tan prolongado se haya llevado un cuidadoso control de la temperatura (Michener y Elliott, 1964). En el rango de temperaturas que permite tanto el crecimiento de los mesófilos típicos como el de los psicrotrofos la fase de latencia de estos últimos es mucho más corta.  La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura; por debajo del óptimo, el crecimiento es más lento y en los rangos inferiores por debajo de 0º C) el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas.
Las bajas temperaturas tienen una importante acción selectiva sobre las floras mixtas constituidas por mesófilos y psicrotrofos y pueden afectar a la composición de la carga inicial de un alimento determinado, además de conducir a modificaciones instanciales de la flora desarrollada a lo largo del tratamiento tecnológico o el almacenamiento. Así, por ejemplo, una carne vacuna refrigerada obtenida en un clima semitropical ofrece un periodo de vida útil, en condiciones de refrigeración, más largo que el de una carne similarmente tratada procedente de zonas más frías (Empey y Scott, 1939). Esta diferencia es debida al efecto de terminología hoy habitual, este último debe clasificarse como psicrotrofo.

De acuerdo con la temperatura sobre la proporción de microorganismos tolerantes de las bajas temperaturas en la carga inicial procedente del suelo y la piel del animal; la carne de bóvido de las áreas mas frías tiene una proporción más elevada de psicrotrofos.  La temperatura de almacenamiento ejerce una poderosa influencia sobre la microflora de la leche. La leche cruda mantenida a unos 10º C desarrolla una flora en la que dominan los estreptococos acidolácticos, en tanto que si es mantenida en las proximidades de 0º C la flora dominante está constituida principalmente por bacterias Gram negativas psicrotrofas (Mocquot y Mucluzeau, 1968).

El enfriamiento rápido de las bacterias mesófilas, desde una temperatura normal de crecimiento hasta 0º C, causa la muerte o lesiona un cierto porcentaje de las células que componen el cultivo. Las bacterias Gram negativas, como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosas, P. fluorescens, diversas especies de Salmonella y Enterobacter aerogenes, parecen ser más susceptibles al frío que los microorganismos Gram positivos, aunque también se haya observado el shock del frío en Bacillus subtilis y Clostridium perfringens (Sato y Takahashi, 1969; Traci y Duncan, 1974). Staphylococcus aureus es resistente al shock del frío, pero Jackson (1974) observó que un cultivo de este microorganismo en caldo tripticasa soja incubado a 5º C, manifestó un incremento en la sensibilidad al agar manitol salado evidenciando así su lesión. Los microorganismos psicrotrofos parecen ser menos sensibles al frío (Farrelí y Rose, 1968).
El crecimiento a temperaturas inferiores a la óptima puede provocar numerosas modificaciones morfológicas y fisiológicas de los microorganismos. Entre las modificaciones morfológicas cabe citar el incrementeo del tamaño celular en la levadura Candida utilis (Rose, 1968) y en Escherichia coli (Shehata y Marr, 1975), la formación de filamentos en E. coli (Shaw, 1968), así como el deterioro de los mesosomas y la formación de doble pared celular en B. subtilis (Neale y Chapman, 1970).

El descenso diferencial de las actividades de los enzimas a bajas temperaturas puede alterar las rutas metabólicas y sus productos finales. Por ejemplo, los microorganismos que sintetizan pigmentos de fenacina y carotenoides tienden a rendir tasas más altas de estos productos a bajas temperaturas, lo que tiene cierta trascendencia en la alteración de los alimentos (Witter et al., 1966). La producción de dextranos extracelulares por Leuconostoc y pediococos se ve favorecida por las temperaturas inferiores a las óptimas de crecimiento de estas bacterias (Rose, 1968).

La producción de lipasa y proteinasa por Pseudomonas y otros géneros ocurre preferentemente a bajas temperaturas (Jezeski y Olsen, 1962; Alford y col., 1971; Juffs, 1976). Algunos de estos enzimas son termorresistentes y pueden persistir después del tratamiento térmico. Muchos de los procesos reguladores del metabolismo celular son sensibles a las temperaturas inferiores a la óptima, de modo que la exposición a las bajas temperaturas puede provocar desequilibrios metabólicos y el cese del crecimiento (Rose, 1968).
La incubación a bajas temperaturas puede alterar igualmente la composición lipídica de las células microbianas (Marr e lngraham, 1962). El contenido lipídico final de las bacterias es independiente de la temperatura de crecimiento (Cronan y Vagelos, 1972), pero el de las levaduras aumenta ligeramente al descender la temperatura (Kates y Baxter, 1962).
Tanto las bacterias como las levaduras experimentan un incremento en la proporción de acidos grasos insaturados a medida que disminuyen las temperaturas de crecimiento; en las bacterias se producen además menos ácidos grasos que contienen el anillo del ciclopropano (Gill, 1975).
También se han citado incrementos en la insaturación de los alcoholes de las ceras producidos por las cepas mesófilas de Acinetobacter crecidas a bajas temperaturas (Gallagher, 1971). El incremento de la proporción de ácidos grasos no saturados al descender la temperatura se cree esencial para que las membranas cumplan su función, dado que la alteración provocada desciende la temperatura a que los lípidos de la membrana "se congelan".
La proporción de ácidos grasos no saturados puede ser responsable de la capacidad de las células que soportan del frío, pero en los auxotrofos de. E coli para los ácidos grasos la distribución de estos en los lípidos de la membrana (siempre que en el medio de cultivo se hallen presentes tasas mínimas de ácidos grasos saturados y no saturados) puede variar dentro de amplios límites sin que aparentemente se vea afectada la capacidad del microorganismo para crecer a bajas temperaturas (Cronan y Gelmann, 1975).
Los alimentos pueden alterarse bajo la acción de microorganismos pertenecientes a los cuatro grupos en que se han clasificado en virtud de su respuesta a la temperatura: psicrofilos, mesófilos y psicrotrofos.
Sin embargo, si los alimentos han sido refrigerados y mantenidos a las temperaturas de refrigeración adecuadas (inferiores a 7º C) la alteración sólo será causada por los psicrotrofos. Aunque los tiempos de generación de los psicrotrofos parezcan muy prolongados, los largos periodos de almacenamiento a refrigeración utilizados en muchos alimentos permiten que la población psicrotrófica alcance tasas de muchos millones por gramo en unos pocos dias, lo que frecuentemente resulta en la aparición de alteraciones desagradables en el olor, el gusto y la textura. Deben evitarse las fluctuaciones en la temperatura de almacenamiento porque la velocidad de crecimiento aumenta rapidamente con ella.


 
La mayor parte de los patógenos son mesófilos y, con pocas excepciones, su crecimiento no constituye un problema en los alimentos refrigerados. Las salmonelas no crecen a temperaturas inferiores a unos 6º C (Matches y Liston, 1968) y en un caldo rico la fase de latencia a 10º C de la S. typhimurium es de aproximadamente 12 horas y su tiempo de generación de unas 8 horas. El crecimiento en los alimentos puede ser mucho más lento.  Así, por ejemplo, tanto la Salmonella senftenberg como la S. ententidis y la S. manhattan son incapaces de crecer a 10º C en ensalada de jamón o natillas, aunque crezcan a 7º C en pollo "a la King" (Angelotti y col., 1961). Goepfert y Kim (1975) observaron que, en carne de vaca picada y cruda, no crecían a 7º C inóculos de cinco serotipos de salmonella multiplicandose, en cambio por 300 en cinco días a 12,5º C.
Clostridium perfringens puede crecer a temperaturas entre 12 y 50º C, pero su desarrollo es muy lento por debajo de 15º C (Michener y Elliott 1964; Roberts y Hobbs, 1968; Hobbs, 1969). Las celulas vegetativas del Clostridium perfringens son sensibles a las bajas temperaturas y el almacenamiento prolongado de los alimentos a temperaturas de refrigeración es probable que resulte en su destrucción lenta si las contienen. Los esporos no se ven afectados en el mismo grado por las acciones de las bajas temperaturas (Canada y col., 1964).   La velocidad de crecimiento se ve afectada además por el pH y la composición del medio, de modo que el crecimiento del C. perfingens es más lento en un medio a pH 5,8 que en otro de 7,2. (Barnes y col., 1963). Se ha observado la germinación de esporos de clostridios a 5º C, es decir, por debajo de la temperatura mínima de crecimiento (Roberts y Hobbs, 1968). Staphylococcus aureus es capaz de soportar las bajas temperaturas y de crecer hasta a unos 7º C (Angelotti y col., 1961). Pero el límite inferior para la producción de toxinas es algo más elevado. Se han detectado, por ejemplo, enterotoxinas en alimentos mantenidos a 10º C (Genigeorgis y col., 1969; Tatini, 1973) pero por debajo de 20º C su producción es lenta. Alcanzar niveles detectables de toxina (1 mg/ml) a 13º C exigió en una cepa 158 horas. Otras cepas crecen a 13º C pero son incapaces de producir toxina a menos de 19º C Scheusner y col.,(1973).
En un medio rico, a pH 7, el tiempo necesario para la producción de toxina en cantidades mensurables osciló en la cepa estudiada por Scheusner y col. (1973) entre 78 – 98 horas a 19º C y 14 – 16 horas a 26º C. Bajo condiciones menos favorables, la producción de toxina fue más lenta. Aunque se alcancen poblaciones abundantes de S. aureus, la producción de enterotoxina puede inhibirse mediante las acciones independientes e interactivas de la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno, la actividad de agua y el desarrolo competitivo de otros microorganismos (Tatini, 1973).
Vibrio parahaemolyticus es sensible a las bajas temperaturas y las intoxicaciones alimentarias producidas en Japón por este microorganismo suelen acaecer en los meses más cálidos del año. En la superficie del pescado marino al crecimiento parece cesar a temperaturas inferiores a 5 – 8ºC, aunque el microorganismo puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo (Sakazaki, 1973) El Vibrio parahaemolyticus puede multiplicarse hasta alcanzar niveles peligrosos al almacenar ostras a temperaturas de 10º C durante una semana (Thomson y Thacker, 1973). La temperatura de crecimiento más baja publicada para el V parahaemolyticus en medios de cultivo es de 5º C (Beuchat, 1973); pero, el crecimiento a esta temperatura se ve fuertemente influido por el pH.  Bacillus cereus crece en el rango de temperatura de 7º a 45º C (Chung y col., 1976) y el Bacillus subtllis entre 12 y 55º C (Riemann, 1969). No se han encontrado pruebas de que el E. coli enteropatógeno crezca a temperaturas inferiores a las mínimas de los demás E. coli. El número de E. coli enteropatógenos recuperables de los quesos blandos aumenta durante el almacenamiento a 4º C, pero no está claro en las experiencias en que se hizo esta observación si tal incremento era debido a la multiplicación del microorganismo o a la recuperación después del shock térmico (Fantasia y col., 1975).
A Park y col., (1973) estudiaron el comportamiento de seis cepas de E. coli enteropatógeno en el queso Camembert a lo largo de un proceso de maduración de 7 semanas a 10º C y observaron un marcado descenso de las tasas de cuatro de ellas; en las otras dos las tasas aumentaron ligeramente durante la primera semana y decrecieron rapidamente en las seis restantes.  Se han aislado microorganismos similares a la Yersinia enterocolitica en carne envasada a vacío y mantenida a 1 – 3º C (Hanna y col., 1976). También se ha comprobado la producción de aflatoxina, oclaratoxina A y tremortinas A y B a 4 – 5ºC en diversos alimentos (Diener y Davis, 1967; Farhat y Koburger, 1975;Trenky col., 1971;Hou y col., 1971).

g. POTENCIAL DE OXIDACIÓN – REDUCCIÓN O POTENCIAL REDOX


Mientras que el pH de los alimentos se mide con facilidad y se comprende la significación de su medida, mucho más difícil resulta medir la repetibilidad del potencial de oxidación – reducción (Potencial Redox), sobre todo entre laboratorios diferentes, y además no está clara la significación que en la microbiología del producto tienen los valores hallados.  Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. Las diferencias observadas en los productos finales del metabolismo, discernibles por el consumidor por diferencias de color o sabor, pueden ser en algunos casos la consecuencia de diferencias redox.
En los alimentos picados (e.g., productos cárnicos) o en los productos no homogéneos (e.g., emulsiones), el potencial redox puede variar considerablemente de una parte a otra debido a altas concentraciones localizadas de diversos pares redox o de nutrientes como glucosa, fumarato o malato. Cuando se encuentra restringida la difusión gaseosa hacia el centro del alimento pueden existir gradientes de potencial redox desde la atmósfera hasta las partes profundas del alimento. El potencial redox indica las relaciones de oxígeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energía y sintetizar nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular. Los microorganismos aerobios necesitan para crecer valores redox positivos mientras que los anaerobios frecuentemente requieren valores redox negativos. En diferentes cultivos microbianos el valor redox puede oscilar dentro de un rango comprendido entre una cifra anaeróbica inferior a unos -420 milivoltios (mV) hasta una cifra aeróbica de aproximadamente +300 mV.
Los procesos de oxidación y de reducción se definen en términos de migraciones electrónicas entre compuestos químicos. La oxidación es la pérdida de electrones mientras que la reducción es la ganancia de electrones. Cuando se oxida una sustancia (libera electrones) siempre se reduce simultáneamente otra (o sea, capta los electrones liberados). Este concepto electrónico ha sugerido el desarrollo de métodos para estudiar cuantitativamente los procesos de oxidación-reducción reversibles que son vitales para las células vivas.  La medida del potencial de electrodo permite determinar el grado de reducción o de oxidación de una sustancia alimenticia determinada. Esta medida sugiere la posibilidad de clasificar los sistemas oxidantes y reductores de los alimentos en base a su intensidad.
Todo proceso redox reversible puede expresarse así:

[oxidante] + [H+] + ne = [reductor]
expresión en la que ne es el número de electrones transferidos en el proceso.



El potencial redox (Eh) de tal proceso viene dado por la ecuación concebida y desarrollada originalmente por Nernst (Pirt, 1975):
Eh = Eo + (RT/nF) ln [oxidante]/[reductor]
en la que Eo es el potencial redox estándar a pH 0 pero en presencia de otros solutos a concentración 1 M (normalmente se mide como el potencial redox del punto medio a pH 0 y se supone que su valor es igual al valor teórico de los pares redox en solución acuosa diluida), R es la constante del gas molar, T la temperatura en ºK, F la cantidad Faraday de electricidad, n el número de electrones transferidos en el proceso y ln el logaritmo natural.
En muchos alimentos es difícil obtener la verdadera medida del potencial redox. Para que el potencial redox de una muestra represente fielmente el del alimento de que fue tomada es esencial que se mantenga inalterado el ambiente gaseoso tanto si el alimento está envasado a vacío, envasado bajo una atmósfera anóxica o envasado en contacto con el aire. Puesto que el potencial redox desciende a consecuencia de la actividad metabólica, el transporte de la muestra deberá realizarse bien en condiciones de refrigeración (0 – 4º C) o a la temperatura de almacenamiento del alimento. La temperatura. y el tiempo del transporte deberán especificarse para ser consideradas en la interpretación de los resultados. El oxígeno es el principal agente que interfiere la medida del potencial redox. En general no deben usarse en la determinación del potencial redox muestras extraídas porque el oxígeno puede penetrar en la muestra durante el muestreo. Para evitar que el oxígeno contamine las muestras deberá quitarse la capa superior de la muestra de alimento bajo gas inerte para efectuar la medida.
Puesto que los valores de potencial medidos dependen del pH, cada medida de potencial redox deberá ir acompañada de la medida del pH. El pH puede cambiar el potencial redox real, pero también para el mismo valor Eh el pH puede crear condiciones favorecedoras de diferentes tipos de metabolismo. Roberts (1970) ha demostrado la influencia del pH sobre el potencial redox limitante del crecimiento del Clostridium perfringens mediante la interpretación de los datos de Ranke y Bailey (1945).
El concepto de rH se introdujo para eliminar por cálculo ésta dependencia del pH. Mientras que el rH puede calcularse exactamente cuando todos los iones hidrógeno están completamente disociados a todos los valores pH, cuando el grado de disociación es alterado por el pH se producen inexactitudes. Además, los ácidos monovalentes alteran el potencial redox 30 mV por unidad pH, los ácidos divalentes 57,7 mV y los ácidos de valencia superior hasta 120 mV. Para convertir el Eh (en voltios) en rH puede usarse la siguiente fórmula.
Eh = 0,03 (rH - 2 · pH) o rH = Eh / 0,03 + 2 · pH
El potencial redox se mide con un electrodo de metal inerte (normalmente platino) en un circuito con un electrodo de referencia. Alternativamente pueden utilizarse colorantes que cambian de color a determinados potenciales redox si bien estos indicadores pueden interactuar con los microorganismos y los alimentos obteniéndose falsos valores.
El electrodo de platino responderá a cualquier sistema que produzca una reacción electroquimicamente reversible en la superficie del electrodo, siempre que la velocidad de reacción sea rápida en comparación con la captura o liberación de electrones del electrodo medidor.
Con los modernos sistemas de medida de alta impedancia (1013 ohmios) pueden medirse potenciales verdaderos a partir de pares redox que producen corrientes de cambio muy bajo. En los sistemas que reaccionan con relativa rapidez tales como el Fe2+/Fe3+ pueden obtenerse medidas cuando la concentración del par es tan baja como 10-5 M (Harrison, 1972). La calibración de electrodos redox está relacionada teóricamente al electrodo de hidrógeno estandar, aunque en la práctica se usa un electrodo de calomelano u otro tipo de electrodo de referencia. Para la medida potenciométrica del potencial redox de muestras de alimentos líquidos se usan los electrodos de platino estandar y de calomelano. Para medidas sobre alimentos sólidos se necesita utilizar electrodos especiales con punta de platino afilada, que tengan escaso diámetro y gruesa pared y puentes de CIK-agar en tubos con punta rellena de fibras de asbestos fundido. A diferencia de los electrodos de pH, los electrodos redox requieren cierto tiempo (dependiente del tipo de muestra) para revelar el potencial redox.
El potencial redox de los alimentos depende de las cantidades relativas de sustancias oxidadas y reducidas que contengan. Los alimentos que tienen grandes cantidades de tales sustancias son resistentes a los cambios del potencial redox y se llaman "fuertemente tamponados". De aquí que no sea fácil la interpretación de la lectura arrojada por un electrodo redox insertado en un alimento, puesto que el alimento puede estar o no fuertemente tamponado. En los alimentos débilmente tamponados una pequeña población microbiana (< 105/g) posiblemente puede causar un cambio del potencial redox, mientras que en los alimentos fuertemente tamponados una población microbiana grande (> 108/g) apenas puede afectar al potencial redox.

Para poder juzgar la significación de cualquier cambio del potencial redox de un alimento hay que tener en cuenta el potencial metabólico y el tamaño de la población microbiana en relación con la capacidad tampón redox del alimento.

Las medidas redox tienen la máxima utilidad cuando existen pares reversibles de componentes conocidos que se encuentran en equilibrio. Todo alimento puede contener pares redox pero algunos no se encuentran en equilibrio y otros son irreversibles. Se ha sugerido que la sonda redox puede ser un monitor adecuado de alteraciones o cambios deseables durante el almacenamiento de alimentos envasados a vacío, bajo atmósferas de gas anóxico o enlatados. Se ha visto que indica con exactitud tales cambios profundos en la carne en postrigor (véase Barnes e Ingram, 1956), donde se encuentran relaciones empíricas reproducibles entre los eventos metabólicos y el potencial redox.
En tales circunstancias los principales sustratos o productos microbianos muestran alta actividad con el electrodo y pueden enmascarar todas las reacciones colaterales o interferentes de forma tal que el potencial redox medido es la verdadera representación del estado del par redox dominante.
En presencia de oxígeno todos los pares redox de los alimentos tienden hacia el estado totalmente oxidado. Aunque el oxígeno disuelto no influye en la sonda de platino en presencia de agua pura, en presencia de soluciones salinas (incluyendo alimentos tales como el jamón y las verduras encurtidas) se producen reacciones electrolíticas que pueden sensibilizar la sonda al oxígeno disuelto (Harrison, 1972) haciendo que indique valores redox artificialmente altos positivos).
En tales circunstancias el potencial redox aparente será función del logaritmo de la concentración del oxígeno disuelto y por tanto grandes cambios del potencial redox representarán pequeños cambios de la tensión del oxígeno disuelto. Jacob (1970) señaló una caída de 60 mV por el 90 % de reducción de la concentración del oxígeno disuelto. A tensiones de oxígeno disuelto muy bajas las sondas redox pueden exhibir relaciones empíricas entre el oxígeno y los cambios metabólicos (Wimpenny, 1969). Sin embargo, a estos bajos niveles de oxígeno la bioquímica de los microorganismos y los alimentos bioquímicamente activos sufren cambios metabólicos que alteran de forma impredecible estas relaciones.
El potencial redox y el pH se pueden controlar en los medios de cultivo, y probablemente en los alimentos, ajustando la concentración de O2 gaseoso y CO2 del espacio de cabeza existente sobre el medio (Dobson y Bullen, 1964). Aunque en teoría puede alcanzarse un equilibrio estable entre las concentraciones en las fases de gas y de agua (relativas a la solubilidad de los gases en el medio de cultivo y la temperatura), la captación de O2 y la liberación de CO2 por los cultivos microbianos excederá con frecuencia de tales concentraciones. El potencial redox puede reducirse rapidamente durante la germinación y crecimiento de los esporos puesto que, aunque inicialinente sólo germina una pequeña proporción de los esporos, los esporos que germinan y crecen producen nicotinamida adenín dinucleótido reducido (NADH) y otros reductores que reducen la concentración de oxígeno a un nivel no inhibidor para los esporos remanentes.

Esta reducción del nivel de oxígeno y la mayor tensión de H2 producida por el metabolismo celular se traduce en una gran caída del potencial redox. Los ambientes creados en los alimentos pueden categorizarse a groso modo como aquellos en los que el acceso de oxígeno está restringido y en los que no está restringido.

En los que el acceso de oxígeno es limitado los microbios que se desarrollan producen CO2 + H2O como principales productos finales; aunque la producción de productos finales tales como ácidos orgánicos no es significativa, entre los metabolitos secundarlos pueden incluirse aminas, etc. Cuando el acceso al oxígeno es restringido ocurre la fermentación y pueden impartirse cambios de aroma al alimento antes de que se altere. Antes de que tales cambios sean detectables por el consumidor tiene que alcanzarse un alto número de microorganismos (> 106 /gm). Algunos microorganismos, como los aerobios estrictos y los anaerobios, sólo poseen un sistema metabólico terminal para obtener energía y en consecuencia sólamente son activos dentro de un margen de potencial redox relativamente estrecho. Otros, como los anaerobios facultativos, tienen sistemas alternativos que pueden ser puestos en marcha o paro por el potencial redox o la presencia o ausencia de oxígeno.




h. SALES DE CURADO Y SUSTANCIAS ANÁLOGAS

En sus comienzos el curado se desarrolló para conservar ciertos alimentos mediante la adición de cloruro sódico. Una impureza de la sal, el nitrato sódico, se vio que era el responsable de la aparición del pigmento rosa – rojizo de la carne, el llamado color de carne curada. Más tarde se comprobó que el compuesto responsable de la aparición del color era el nitrito y no el nitrato que se originaba por reducción bacteriana del último. En la actualidad se consideran sales del curado al cloruro sódico y al nitrito o nitrato de sodio o de potasio.  Aunque el curado constituía originalmente un mecanismo de conservación por salazón, se han desarrollado simultáneamente con aquél varios miles de procesos adicionales principalmente fermentación, ahumado, desecación y aplicación de calor. En los últimos cincuenta años se han ideado una serie de productos curados que solo permanecen estables en condiciones de refrigeración. De hecho la mayoría de los productos cárnicos curados deben mantenerse en refrigeración para que conserven su inocuidad y salubridad y durante las últimas dos décadas hasta el envasado de muchos tipos de productos curados ha supuesto un factor importante para prolongar el tiempo durante el que el producto mantiene su salubridad.
Además de las sales del curado y de los procesos con ellas relacionados, ya mencionados, en muchos productos cárnicos curados se emplean aditivos conocidos colectivamente como adyuvantes. En ellos se incluyen ascorbatos, fosfatos, glucono lactona y azúcares. Los adyuvantes se emplean fundamentalmente para alcanzar o mantener ciertos cambios deseables; los ascorbatos en relación con el color y los demás con respecto al pH, textura y en ciertos casos aroma. Los adyuvantes también pueden afectar a la sanidad del producto.
El término de "curado" se utiliza mucho en varias industrias siempre en relación con un cambio deseable, por ejemplo en la preparación de cuero, fabricación de acero, endurecimiento de mortero y también en la conservación de alimentos. Sin embargo, incluso en la industria de los alimentos, la denominación de curado se relaciona unicamente con ciertos productos cárnicos y de pescado y con los quesos.  Hasta en estos alimentos la palabra "curado" puede tener distintas connotaciones: a la carne se le adicionan siempre sal y nitrito o nitrato; al pescado, también se le añade siempre sal, mientras que el nitrato se le adiciona en muy raras ocasiones y en el queso, que siempre contiene sal y rarísimamente nitrato, el término curado se aplica a la producción de cambios proteolíticos y lipoliticos deseables. De hecho el significado de "curados", incluso en la industria de los alimentos depende de la costumbre; por ejemplo, tanto la mantequilla como ciertas hortalizas adobadas necesitan sal como parte de su sistema conservador, pero nunca se les denomina productos curados. Las sales del curado, los adyuvantes y los procesos con ellos relacionados, ya citados, modifican el alimento base; entre tales modificaciones se incluyen las del color, aroma, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano; éste, dependiendo del producto, puede ser deseable, causar alteración u originar una toxiinfección alimentaria.
La historia del curado comenzó hace miles de años cuando el hombre aprendió a conservar la carne por salazón. La presencia de nitrato en la sal común es responsable del enrojecimiento de este alimento. Sin embargo, el nitrato como tal se utilizaba incluso antes de la era cristiana en las antiguas civilizaciones de China e India. Los escritores romanos describen el curado de la carne por salazón, ahumado y acidificación (Binkerd y Kolari, 1975).  Hacia finales del siglo XIX se sabía que las bacterias reducían el nitrato a nitrito durante el curado de la carne y que el responsable del enrojecimiento era el nitrito y no el nitrato. Sin embargo, hasta 1923 no se permitió en EE. UU. la adición de nitrato a la carne. Actualmente en la mayoría de las carnes curadas se tiende a emplear solamente sal y nitrito, si bien en ciertos productos se utilizan todavía el nitrato o las mezclas de nitrato y nitrito.
El nitrato se ha empleado en Europa desde hace unos ciento cincuenta anos en la elaboración de quesos salazonados mediante inmersión en salmuera. La concentración de cada uno de los agentes del curado depende de la naturaleza de los alimentos y de la tecnología empleada en cada país; en donde se dispone de refrigeración suficiente los productos cárnicos más corrientes son los ligeramente salados que necesitan mantenerse en refrigeración. Por el contrario, en climas cálidos y en donde no se dispone de suficiente refrigeración los productos más corrientes son los fermentados e intensamente salados (autoestables).
En consecuencia los productos curados reflejan las economias y climas nacionales, constituyendo parte de las culturas nacionales y hasta regionales. De aquí que haya amplias diferencias entre los embutidos curados preparados en países distintos. Una afirmación similar puede hacerse para el pescado y quesos curados. No obstante, el resto de este capitulo se dedicará fundamentalmente al curado tal y como se aplica a la carne.
Las carnes curadas pueden dividirse, de forma bastante amplia, en tres grupos: sin calentar, calentadas ligeramente (pasteurizadas hasta una temperatura en su centro de 65 – 75º C) y tratadas a temperaturas altas (autoestables, después de un calentamiento de l00 – 120º C).

En general sólo unos pocos productos sin calentar (ciertos tipos de jamón y embutidos, bacon y costillar ligeramente salado) necesitan almacenarse en refrigeración, mientras que la mayoría de los calentados ligeramente deben someterse a refrigeración después de tratados por el calor; sin embargo, los que se someten a temperaturas altas en climas templados y en recipientes herméticamente cerrados son indefinidamente estables.

Cuando se incorpora nitrito a un sistema alimentario se suceden una serie compleja de reacciones cuya naturaleza depende de las características físico-químicas del sistema. Se desconocen muchas de las reacciones. El nitrito adicionado a la carne se convierte en una mezcla en equilibrio de NO-3, NO- 2 y NO, dependiendo del pH y del Eh (Shank y col., 1962; Ingram, 1973). El nitrito desaparece como resultado de sus reacciones químicas con los componentes de la carne o de la actividad metabólica de los microorganismos. En las reacciones con la carne pueden estar implicados los pigmentos hemo (Möhler, 1973), las proteínas no hemo (Woolford y col., 1976) y otros compuestos. Del 70 al 80 % aproximadamente del nitrito adicionado a la carne puede recuperarse en los siguientes porcentajes: nitrato 1-10; nitrito 5-20; gas 1-5; productos de su reacción con la mioglobina 5-15; id. con las proteínas 20-30; con el grupo sulhidrilo 5-15 y con los lípidos 1-5 (Cassens y col., 1976).
Unos pocos componentes de la carne (cisteina e histidina) y los aditivos ascorbato e isoascorbato parece que son los responsables de las pérdidas mayores de nitrito; los agentes reductores median en la conversión del nitrito en óxido nítrico, pero se desconoce el papel de la histidina (Fox y Nicholas, 1974). Parte del nitrito se convierte en nitrato mediante diversas reacciones químicas especialmente en presencia de ascorbato y en curaciones prolongadas (Herring, 1973; Fujimaki y col., 1975; Möhler y Baumann, 1971), con tal que exista oxígeno o algún otro aceptor adecuado de hidrógeno.
Si el nitrito de los productos enlatados esté en cantidades excesivas, durante el tratamiento térmico puede dar lugar a la liberación de óxidos de nitrógeno gaseosos que pueden causar abombamiento (Morris, 1952). La velocidad a que desaparece el nitrito de los productos cárnicos tratados por el calor depende del pH y de la temperatura; a medida que desciende el pH y sube la temperatura se acelera la velocidad a que desaparece (Oliman y Krol, 1972). Por ejemplo la vida media en horas a un pH de 6 y a varias temperaturas será: a 100º C, 1,8; a 77º C, 6,7; a 24º C 126 y a 7º C 376. Algunos microorganismos también contribuyen a la desaparición del nitrito al utilizarlo como aceptor de hidrógeno.
Las levaduras (Wickerham, 1957) y las bacterias (Pivnick, datos sin publicar) pueden llevar a cabo esta operación en las carnes curadas envasadas al vacío en plásticos impermeables al oxígeno; el desarrollo de ciertas bacterias reductoras del nitrito persiste en este ecosistema hasta que se agota todo el nitrito.
En la carne curada enlatada el nitrato sirve de aceptor de hidrógeno de las bacterias aerobias,por ejemplo Bacillus spp y micrococos; generalmente en ausencia de aquél no se multiplican. La reducción microbiana del nitrato o del nitrito a N2O y N2 puede producir abombamiento (Eddy e Ingram, 1956).


Los principales agentes del curado y adyuvantes que afectan al aroma son la sal, el azúcar, el humo y el nitrito. El azúcar se utiliza en bastante cantidad en ciertos tipos de bacon y jamones pero su contribución al aroma en otros productos es todavía objeto de controversia; el humo, como aromatizante, se estudiará más tarde. El nitrito reacciona con los componentes de la carne, especialmente de la de cerdo, modificando su aroma y este aroma modificado se acepta más que el de la carne de cerdo curada exclusivamente con sal (Barnett y col., 1965; Mottrant y Rhodes, 1973).  La concentración óptima oscila entre 15 y 150 ppm de nitrito,dependiendo del producto. Se desconoce el fundamento químico del aroma del curado a pesar de las numerosas investigaciones realizadas, pero se ha sostenido la hipótesis de que parte del aroma a curado se debe a la ausencia de productos de la degradación oxidativa de los lípidos insaturados, por ejemplo hexanal y aldehido valérico. La sal y el hierro aceleran la oxidación y ésta es más rápida en la carne de cerdo que en la de bóvidos ya que posee más lípidos insaturados que la última (Wilson y col., 1976).
El nitrito retarda la velocidad de la oxidación; por lo tanto la diferencia entre la carne con y sin nitrito estriba en que en la primera la oxidación de los lípidos es menor (Cross y Ziegler, 1965 ;Cho y Bratzler, 1970; Mottram y Rhodes, 1973; Wasserman, 1973; Hadden y col., 1975). Se han hecho algunos trabajos (Simon y col., 1972) con salchichas frankfurt de cerdo y de vacuno elaboradas con y sin nitrito que apoyan esta afirmación: las fabricadas con carne de cerdo sin nitrito o con niveles de nitrito bajos fueron organolépticamente menos aceptables que las de vacuno .Las especias y el ahumado pueden mejorar la aceptación organoléptica de los productos elaborados sin nitrito (MacNeil y Mast; 1973;Wasserman, 1973).
En la carne que ha sido tratada por el calor y refrigerada (Wilson y col., 1976; Sato y Hegarty, 1971) se ha observado un defecto conocido como "aroma a sobrecalentado" ("warmed over" flavor (WOF)). Se debe al aumento, favorecido por el hierro, de los lípidos oxidados tales como heptanal,n-nona-3,6-dienal y otros compuestos semejantes (Ruenger y col., 1978). El nitrito previene o disminuye la producción de WOF, defecto qúe también se evita al producirse antioxidantes durante un calentamiento intenso (por ejemplo; F0 = 17; Einerson y Reineccius, 1977), o adicionando algunos antioxidantes, v. gr., hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) y galato de propilo. Todo ello está en favor de la hipótesis de que el aroma a curado se debe, al menos en parte, a la inhibición de la oxidación de los lípidos.
La adición de nitrito a la carne transforma los pigmentos cárnicos, en especial la mioglobina y en menor extensión la hemoglobina, en un pigmento rojo,insoluble en agua, la oxido nitrico mioglobina. El calentamiento transforma este pigmento en otro rosa, el nitrosil-hemocromo que se estabiliza con los ascorbatos. Los pigmentos de carne curada pueden originarse por reacciones químicas, bioquímicas o enzimáticas, dependiendo de que se caliente la mezcla carne-nitrito y del tiempo transcurrido entre la adición de nitrito y el calentamiento (Móhier, 1973). La reacción del curado la aceleran el pH bajo, las condiciones reductoras y las temperaturas altas (Fox y Ackerman, 1968); en condiciones óptimas la adición de 15 ppm de nitrito sódico produce el máximo color en los productos picados y emulsionados y unas 50 ppm dan el máximo color al bacon de los flancos.


Estas concentraciones de nitrito tienen escaso o ningún efecto antibacteriano; las bacterias no ejercen otro papel fundamental en la producción del color salvo reducir el nitrato a nitrito y en ciertos productos bajar el Eh y el pH. El Eh desciende también bajo la acción del calentamiento y del ascorbato y el pH bajo el efecto de la glucono-d-lactona y del pirofosfato ácido de sodio.  La reacción principal parece ser la formación de un intermediario nitroso reductor entre el nitrito y los diversos agentes reductores y la escisión del intermediario para liberar óxido nítrico. Entonces el óxido nítrico producido reemplaza al agua unida al hierro en la porción hemo de la mioglobina o hemoglobina.
En la carne hay muchas reacciones que compiten por los ascorbatos. Los ascorbatos tienen interés como aceleradores del desarrollo y estabilizadores del pigmento de la carne curada. Influyen además en la actividad anticlostridial del nitrato en las carnes pasteurizadas enlatadas, cuyo efecto aumenta si existe una proporción adecuada de ascorbato (Schack y Taylor, 1963; Tompkin y col., 1 978a,b,d) o disminuye cuando su concentración es excesiva (Tompkin y col., 1979b).
Sus principales efectos beneficiosos en las interacciones quimicas que tienen lugar en las carnes curadas son: (1) como agentes reductores y (2) como quelantes (Tompkin y col., 1978e). Los ascorbatos como agentes reductores actúan como consumidores de oxígeno; disminuyen el Eh; participan en la reducción de la metamioglobina a mioglobina; reaccionan con el nitrito para aumentar la producción de óxido nítrico que reacciona entonces con la mioglobina para dar óxido nítrico rnioglobina.  Los ascorbatos secuestran a prooxidantes tan activos como el cobre y el hierro; la quelación del hierro puede ser una de las razones por las que aumenta la actividad antibotulínica del nitrito (Schack y Taylor, 1963; Tompkin y col., 1978a,b, 1979a). 


i. RADIACIONES IONIZANTES EN ALIMENTOS

Entre el conjunto de radiaciones potencialmente utilizables para su aplicación en los alimentos (Proctor y Goldblith, 1951), es necesario distinguir dos categorías diferentes. La primera, es la radiación de frecuencia relativamente baja y de longitud de onda más larga que la de la luz visible, aproximadamente de 107 a 1010 Hz* (*Hz = Hertz, 1 Hz = 1 ciclo por segundo; frecuencia (en Hz) n longitud de onda (en metros) = 3 n 108 ), o sea,las que van desde la onda corta de la radio (10 megaciclos) pasando por la longitud de onda del radar, e inclúyendo los infrarrojos aproximadamente 1012 - 1014 Hz.  Estas radiaciones poseen un bajo poder energético y por lo general su acción sobre las moléculas produce frotamiento con elevación térmica.
A pesar de algunos trabajos en los que se señala una acción específica sobre los microorganismos, la mayoría de los publicados indican que los efectos letales para los mismos, sólo se debe a dicho calentamiento,por lo que no se toman en consideración en este lugar.
 
En la segunda categoría, están las radiaciones de longitud de onda más corta que las de la luz visible, con frecuencias de aproximadamente 1015 Hz o más, las cuales poseen el suficiente poder energético para excitar o modificar las moléculas orgánicas y por tanto son capaces de desarrollar una acción letal específica. Las radiaciones de más baja frecuencia y energía, en la zona ultravioleta (UV) del espectro, sólo son capaces de excitar a las moléculas y son las que se van a estudiar en este capítulo. Aquellas otras de más alta frecuencia, desde 1018 Hz y más, tienen la suficiente energía para romper las moléculas en partes con cargas distintas llamadas iones y a estas radiaciones se les llama “Ionizantes”
La zona UV del espectro se extiende por debajo de la longitud de onda de 450 nm. La longitud de onda más eficaz para la destrucción de microorganismos está alrededor de 260 nm. con un cuanto de energía aproximadamente de 4,9 electrón voltios (eV). Longitudes de onda inferiores a 200 nm. no son eficaces porque se absorben muy rápidamente por el oxígeno atmosférico. Las longitudes de onda desde 360 a 450 nm. se les suele llamar "onda larga ultravioleta", "luz negra" o "ultravioleta próxima". Se utilizan frecuentemente para producir fluorescencia, así por ejemplo, para demostrar la presencia de pigmentos de Pseudomonas en huevos, mediante lámparas ultravioletas. Estas ondas atraviesan fácilmente el cristal y tienen efectos limitados sobre los microorganismos (Thomas, 1977).
Las radiaciones ultravioletas se encuentran en algunas fuentes luminosas de temperatura alta por ejemplo, en la luz solar o en lámparas de arco voltaico), y en ciertos tubos fluorescentes. En la práctica, la fuente habitual de UV es la lámpara de vapor de mercurio de baja presión, que emite varias longitudes de onda específicas, algunas de luz visible, pero alrededor del 80 % del total, es emisión UV a 254 nm., la cual tiene sólo el 85 % de la actividad biológica que correspondería a los 260 nm.  Esta lámpara debe estar construida con un cristal especial que absorba las radiaciones por debajo de 200 nm. las cuales, si son absorbidas por el oxígeno atmosférico, producen ozono, lo que no es conveniente. Las lámparas de mercurio de alta presión que se utilizan para la iluminación, tienen poco poder germicida. Están empezando a utilizarse ahora, las lámparas laser activadas, de mucho más rendimiento.
La intensidad de irradiación* (*irradiación es el proceso por el que se aplica energía radiante sobre un objeto, tal como un alimento), se mide por la energía absorbida por la unidad de superficie, generalmente en ergs/seg µW/cm2 (107 ergs/srg = 1 vatio). Una lámpara de vapor de mercurio a baja presión de 50-vatios proporciona una intensidad efectiva de aproximadamente 100 µW/cm2 a una distancia de 1 m.
La "dosis" de irradiación absorbida se mide por la energía total (o sea, que con una intensidad dada, el producto del tiempo por la intensidad, como se ha definido más arriba) expresada como ergios o µW seg/cm2. Las dosis utilizadas contra los microorganismos, por encima de 105 µW por seg., representan cantidades de energía demasiado pequeñas para producir una elevación significativa de la temperatura (4.2 · l07 ergs = 1 caloría).   Debido a su bajo cuanto de energía, la irradiación UV es totalmente absorbida por las moléculas expuestas. La molécula se excita por la energía absorbida y puede suceder entonces que se produzcan reacciones anormales que provoquen su destrucción, con posibles efectos letales sobre los gérmenes. Existe una absorción marcadamente preferente por determinadas sustancias, como por ejemplo, por los ácidos nucleicos.
La longitud de onda con efectos más letales, alrededor de los 260 nm., es la que en su mayoría se absorbe por las bases de los ácidos nucleicos y existen numerosos datos que indican igualmente que los ácidos nucleicos son el blanco principal de la radiación UV. Sin embargo, por lo que se refiere a los alimentos, es igualmente absorbida al instante por varias sustancias de importancia. Ya se ha señalado la absorción por el oxígeno de las longitudes de onda más cortas. La absorción por el agua está en razón de su transparencia, en el agua pura, la intensidad de absorción se reduce aproximadamente dos tercios por cada 5 cm. de profundidad, pero en agua de río, se absorben dos tercios de energía solamente en 1 cm. de profundidad.
Su actividad se ve también afectada por determinados iones, como por ejemplo, Fe+++. Proteínas y bases también absorben la radiación UV de manera importante, así que en la leche, por ejemplo, una capa de aproximadamente 0,1 mm. de espesor es capaz de absorber el 90 % de la energía incidente. La absorción es aproximadamente proporcional a la concentración de las sustancias citadas, aunque puede decirse que la penetración es siempre menor en los alimentos sólidos.
Puesto que la penetración de la radiación UV es pequeña en los líquidos e insignificante en los alimentos sólidos, su principal aprovechamiento reside en la destrucción de microorganismos suspendidos en el aire o que se encuentren sobre las superficies. Sin embargo, los gérmenes pueden ser también resistentes si se encuentran cubiertos por capas de sustancias protectoras, tales como aerosoles o sobre superficies húmedas o de alimentos grasientos.
La intensidad de radiación de distintas longitudes de onda, se puede medir por métodos físicos, pero no se conoce un método sencillo para determinar la dosis efectiva, la cual se debe apreciar teniendo en cuenta el tiempo y la distancia de una determinada lámpara. Son confusos los intentos para medir directamente los efectos sobre los microorganismos, debido a la gran influencia de los factores extrínsecos e intrínsecos.
Cuando una población uniforme de células microbianas, esporos, o conidios se irradia a una intensidad constante, el número de supervivientes disminuye exponencialmente con el tiempo (o sea, con la dosis total de la radiación aplicada). De aquí se deduce que conviene expresar la resistencia de una especie de microorganismos, como la dosis necesaria para reducir el número de supervivientes a un décimo (esto es, 90 % de letalidad), una cantidad que es virtualmente independiente del número absoluto de microorganismos implicados y de la clase de dosis.
Esta cantidad, como sucede en situación semejante con el tratamiento por el calor, se la puede llamar valor D o "dosis de reducción decimal", Valores D específicos son: Serratia marcescens, 1500 µW seg; Escherichia coli, 2000 µW seg; esporos de Bacillus mesentertcus, 10.000 µW seg.
Para establecer cada valor D con la radiación UV, se necesita mucho más cuidado que con las radiaciones ionizantes, hay que tener en cuenta la absorción de la radiación por el medio, como se ha indicado anteriormente. El valor D depende también de la fisiología y otras características específicas de las células.

Existe una falta de información precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiación UV. Diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta, y la comparación de los datos obtenidos por técnicos diferentes, dan lugar a errores, por haber trabajado con condiciones de irradiación no superponibles, distinta edad de los microorganismos, etc. Consecuentemente, existen discrepancias manifiestas en la literatura disponible.

Hablando de una manera amplia, se ha afirmado que los bacilos no esporulados gram-negativos son los que se destruyen más facilemtne con la radiación UV; los estafilococos y los estreptococos necesitan una dosis aproximadamente cinco veces mayor; los esporos bacterianos alrededor de 10 veces; las esporas de los hongos (sin agua) alrededor de 50 veces, y los virus todavía más (Sykes, 1958). La mayoría de las bacterias gram positivas y los esporos son menos resistentes que lo señalado en estas indicaciones de tipo general.
No obstante, en términos amplios, el orden de resistencia a la radiación UV entre las bacterias, guarda cierta semejanza con el que presentan a las radiaciones ionizantes. Esto es bastante diferente en otras agrupaciones más heterogéneas; así las levaduras son aproximadamente tan resistentes como las bacterias a la radiación UV, mientras que los hongos lo son todavía mucho más;con las radiaciones ionizantes sucede todo lo contrario.
La radiación UV de la clase e intensidad descritas aquí, durante su utilización práctica, posee un peligro inmediato para los obreros, para su piel y especialmente para sus ojos. Son esenciales los exámenes periódicos y/o las limitaciones en el tiempo de exposición. Mientras que se ha divulgado mucho aquéllo que se refiere a los efectos mutagénicos de las radiaciones ionizantes, poco se ha dicho sobre el peligro de tales mutaciones cuando se utillízan radiaciones UV, quizás se debe a que una larga experiencia sin precauciones especiales, y sin efectos nocivos, ha demostrado que el riesgo es insignificante.
Si la lámpara ultravioleta produce una emisión por debajo de 200 mn., existe la posibilidad de que se produzca ozono, el cual, favorece además la oxidación de las grasas, siendo tóxico para el hombre en concentraciones no detectables aún por su olor.


El mayor valor del tratamiento con radiaciones UV se encuentra en el saneamiento del aire, por lo que se utiliza ampliamente con ese objeto. También puede aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos.  En los laboratorios de microbiología de los alimentos, las lámparas ultravioleta se utilizan para esterilizar el aire en aquéllas zonas que contienen cultivo,este uso puede tener un valor especial, cuando las condiciones industriales producen atmósferas fuertemente contaminadas. Igualmente, la luz UV puede servir para controlar en las panaderías el crecimiento sobre el pan de las esporas de los hongos, o para el control de la propagación de los microorganismos en la superficie, pero no en el interior, de los pasteles de crema.  En jarabes de azúcar concentrados contenidos en depósitos grandes, por otro lado microbiológicamente estables, la condensación en la zona superior tiende a que la concentración de azúcar se diluya y sea menor en la superficie del jarabe, lo que permite en la misma, el crecimiento de los hongos que se encuentran en el aire. Esto se puede prevenir instalando lámparas UV sobre la zona superior de los depósitos.
Debido a la limitada penetración de la radiación UV, los líquidos se deben exponer en capas delgadas para facilitar su absorción. Aunque en principio, la luz UV es excelente para el tratamiento del agua, la necesidad de exponerla solamente en capas no mayores de 1 cm. de grosor, da lugar a que el equipo sea complejo y costoso, teniéndose además que clarificar primero el agua. Para destruir una cifra importante de microorganismos, se necesitan tiempos de exposición relativamente largos, así que el rendimiento es bajo. Estas limitaciones hacen este procedimiento menos práctico que la cloración. Para el tratamiento de la leche se necesita exponerla en capas muy finas bajo la fuente de irradiación, haciendo que el control sea difícil y el rendimiento muy bajo. Este tratamiento facilita la oxidación de la grasa y la formación de olores anormales. Por ésto, aunque en condiciones apropiadas se puede reducir el número de bacterias en 90 – 99 %, el procedimiento no tiene valor práctico. La irradiación ultravioleta puede efectivamente destruir los microorganismos de una superficie, por sólo si la superficie previamente se ha limpiado bien y si ha sido sometida a la exposición un tiempo suficiente. Es normal, que sólo estas superficies irradiadas directamente así, se sanean, porque incluso el cristal corriente es relativamente opaco a las longitudes de onda germicidas. La irradiación ultravioleta se puede utilizar para esterilizar envases donde otros métodos como el calor, no se pueden aplicar.
Generalmente los envases deben estar abiertos para permitir que penetre la irradiación, como por ejempío, en el tratamiento del material utilizado para los envases de llenado aséptico de la leche uperizada (UHT). Sólo si el material es transparente para la radiación UV como por ejemplo, algunas bolsas de plástico delgado, se puede tratar el interior sin abrir el envase. El azúcar utilizado en las conservas puede contener esporos termófios, los cuales son difíciles de destruir, excepto por radiaciones UV.  Aproximadamente 10 esporos de Bacillus stearotermophilus por gramo de azúcar se pueden destruir con una exposición de unos 30 minutos, actuando sobre capas de azucar de 4 mm. de espesor, esta penetración quizás esté ayudada por reflexiones múltiples de las superficies de los cristales.  El tiempo de exposición se puede acortar si la capa de azúcar se remueve, pero se alarga mucho si el azúcar tiene terrones. El azúcar se altera poco por la luz UV. Otra aplicación en la industria alimentaria, es en las cámaras de refrigeración utilizadas para almacenamiento de la carne con objeto de impedir el crecimiento de microorganismos en la superficie. La disminución de la contaminación procedente del aire parece ser poco importante.  Aunque la energía que se aplica actualmente a la superficie de la carne es más bien baja, y los microorganisznos son numerosos e íntimamente incrustados en ese substrato protector, existen sin embargo datos frecuentes asegurando que su utilización permite aumentar el tiempo de almacenamiento. Se puede decir de forma general, que los microorganismos se ven afectados, solo cuando la exposición a la radiación ultravioleta incide directamente sobre estas superficies sólidas. Sin embargo, la producción de ozono o la reflexión de los rayos UV pueden tener un efecto menor sobre los microorganismos que se encuentran sobre superficies no directamente expuestas.
El problema a resolver aquí, no obstante, no es la esterilización, sino más bien el frenado de la multiplicación microbiana; en este caso la radiación se aplica de una forma continuada. Con un microorganismo multiplicándose a razón de 10 escisiones en un periodo de 104 - 105 seg. aproximadamente, y a una dosis de reducción decimal de 10 - 103 µW seg.  En efecto los periodos de frenado son así más largos, los factores de crecimiento más bajos, y el máximo de concentración celular más pequeño, incluso con intensidades de irradiación tan bajas se consiguen estos efectos en la superficie de la carne (Kaess y Weidemann, 1973). Por ejemplo, sometiendo carne que contiene Pseudomonas causantes de alteración a irradiación UV, se reduce su factor de crecimiento al 85 % aproximadamente, comparando con una carne testigo no irradiada y utilizando una intensidad en la superficie de 2 µW/cm2 y de 24 µW/cm2 para aproximadamente el 75 %. Para retrasar la reproducción en la superficie de la carne de los hongos procedentes del aire, es suficiente con una intensidad de 0,2 µW/cm2 e igualmente eficaz para restringir la propagación de colonias bacterianas. Lo anterior se consigue actuando a 0º C y en una atmósfera semisaturada [equilibrio de la humedad relativa (EHR) 0,993]; con un EHR de 0,985 se redujo más el crecimiento. La apariencia de mejoramiento fue mayor de lo que realmente se había conseguido, debido a que la irradiación actuó eliminando sólo el crecimiento de la superficie de la carne. Una intensidad de 2 µW/cm2 detuvo la formación de las hifas de los hongos, y 24 µW/cm2 relegaron el crecimiento bacteriano a las zonas capilares por debajo de la superficie de la carne. Las colonias formadas fueron dificilmente visibles y muchas de las bacterias desarrolladas tenían formas largas filamentosas.

El costado "iluminado" de una canal situada a 2 m. de una lámpara sencilla de 25 vatios, puede absorber una intensidad aproximada de 0,2 µW/cm2, dosis que puede ser significativa, e incluso se puede incrementar esta dosis si la habitación tiene paredes con superficies reflectantes. La eliminación de los olores de la alteración por la radiación UV puede engañar al comprador, haciéndole creer que el alimento está fresco y en buenas condiciones. Este efecto no podría conseguirse por la introducción, en su lugar, del ozono (Kaess y Weidemann, 1973). La radiación ultravioleta es inadecuada para su utilización en ciertos alimentos ricos en grasas, especialmente grasas insaturadas, puesto que acelera enormemente la formación de olores a rancio debido a su fuerte acción catalítica sobre la oxidación de los lípidos (manteca expuesta a la luz del sol).
Por ésto, debe restringirse su utilización con productos lácteos, y es mucho más eficaz en las cámaras de refrigeración, para tratar carne de cordero o de vaca que para la de cerdo. La radiación UV produce daños en verduras, formando manchas decoloradas en las hojas. Existen algunos datos que afirman que la radiación UV tiene menos efecto sobre microorganismos en substrato seco que sobre aquéllos que se encuentran en medio húmedo, pero experiencias efectuadas con microorganismos suspendidos en el aire a diferentes humedades relativas, puede que no hayan tomado en cuenta los efectos "clumping", existiendo por ésto, gran discrepancia en el asunto. Se ha señalado que la resistencia en "seco es mas de diez veces superior, comparada con la de atmósferas húmedas, y existen informes sobre un cambio relativamente repentino en la resistencia con humedades relativas cercanas al 60 %. No se conoce información en este caso sobre lo que afecta a los alimentos. La temperatura, dentro de la escala normal de 0ºC a 40ºC, apenas tiene efecto sobre la sensibilidad para las radiaciones UV. Microorganismos expuestos a la radiación UV se muestran después más sensibles al calor y viceversa, como ocurre también con las radiaciones ionizantes. Los efectos letales de la radiación UV, a diferencia de los de la radiación ionizante, no se incrementan mucho con la presencia de oxígeno.
Como la radiación ionizante, la ultravioleta, inhibe la división celular antes de que alcancen el tamaño adecuado; por ésto, las dosis subletales dan lugar a la formación de células filamentosas, las cuales más tarde o reanudan la división celular normal o mueren. Las condiciones que se presentan después de la irradiación tienen una gran influencia en la recuperación de las células irradiadas. Aunque el tema es extenso, poco ha sido lo que se ha encontrado importante para su aplicación en los alimentos; lo más digno de tenerse en cuenta son los efectos revitalizadores de la luz visible ("fotorreactivación") y las indicaciones de que la recuperación de la facultad de crecer tiene lugar mejor en medios sencillos y a temperaturas por debajo de las consideradas como óptimas.  Existe además, otro tipo de radiación ionizante que se caracteriza por poseer un alto contenido de energía, gran poder de penetración, y acción letal debida a su liberación a nivel celular. Hasta hace poco, las aplicaciones principales de la radiación ionizante han sido en el campo de la medicina, en técnica industrial y como procedimiento para estudios genéticos, así como la función y estructura de los microrganismos. La aplicación práctica de la radiación ionizante para destruir microorganismos en productos comerciales (principalmente farmaceuticos) solo se ha desarrollado en las últimas dos décadas. La letalidad para los microorganismos de las radiaciones "alfa", ß, "gamma" y de los rayos X se conocía ya a principios de siglo. Con la excepción de los rayos X, los métodos para la producción de radiaciones ionizantes de una forma económica y controlada y teniendo la intensidad precisa para poderlas utilizar en la industria en gran escala, no estuvieron a punto hasta después de la Segunda Guerra Mundial, cuando los intensos estudios sobre la fisión atómica para fines militares, tuvieron como resultado una más amplia y clara comprensión de las fuentes y de los orígenes de la radiación ionizante, además de una gran acumulación de conocimiento técnico en este campo.
La atención pública se concentró en los usos pacíficos de la energía atómica, y trabajos sobre la conservación de los alimentos por este procedimiento, se iniciaron en varios países durante la pasada década del 50 y han continuado desde entonces con intensidad variable. Inicialinente, sólo se interesaron los pocos países que poseían tecnología atómica, como Estados Unidos, el primero en este campo, pero en los últimos años, el interés sobre la irradiación de alimentos se ha extendido a muchos otros países.
Los primeros trabajos establecieron claramente la utilidad en potencia de la irradiación como un procedimiento de conservación de los alimentos e indicaron desde un punto de vista práctico, que los dos mejores métodos utilizables, serían un dispositivo-generador de electrones (radiación ß) y las radiaciones y originadas en la desintegración de isótopos radiactivos (como el 60Co) formado como un subproducto en el funcionamiento del reactor. Durante la década de 1960 algunos Gobiernos permitieron la utilización de la radiación ionizante para tratar un número limitado de alimentos. Posteriormente, esta autorización fue anulada en Estados Unidos, debido a que los trabajos de experimentación, indicaron que la irradiación podría inducir a la formación de compuestos potencialmente mutagénicos, teratogénicos, o cancerígenos, en determinados alimentos.
Investigadores de varios países, están estudiando la inocuidad de diversos alimentos irradiados en experiencias con animales, por tests de mutagenicidad sobre células y de teratogenicidad (mutaciones letales) con extracto del producto. Por el momento, los resultados confirman la inocuidad del procedimiento, y parece probable que la irradiación podría aprobarse de nuevo como un método de tratamiento de los alimentos.  La literatura de los efectos de la radiación ionizante sobre los microorganismos es amplia y en este capítulo solo pretendemos el estudio de aquéllos hechos importantes para el microbiólogo y que se refieran a los productos alimenticios.



La radiación ionizante presenta algunas ventajas en comparación con otros procedimientos en lo que se relaciona con la destrucción de bacterias en los alimentos:

1. Es altamente letal, pero la dosis puede ajustarse para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes.
2. A niveles bajos (< 0,5 Mrad), no produce cambios organolépticos detectables en el producto.
3. Incluso con dosis altas (> 1 Mrad) son pequenos los cambios químicos totales producidos en el alimento.
4. No deja residuos que no pertenezcan al alimento.
5. Se produce muy poco calor, por lo que los productos crudos mantienen las características del alimento fresco, pudiéndose incluso tratar los alimentos previamente congelados.
6. La penetración de la radiación es instantánea, uniforme y profunda, permitiendo un control preciso del procedimiento (en contraste con el calor).

Existen no obstante ciertos inconvenientes:

1. Normalmente no son inactivados los enzimas cuando se utilizan dosis bactericidas, por lo que pueden permanecer activos en los alimentos durante el almacenamiento.
2. Los cambios químicos, aunque pequeños en su totalidad, pueden dar lugar a alteraciones organolépticas inaceptables en ciertos alimentos sensibles o en alimentos que se han sometido a dosis altas. Estos cambios se asocian generalmente con la presencia de radicales libres, los que a su vez pueden actuar también como un factor bactericida secundario.
3. Algunos estudios han sugerido que la irradiación de alimentos puede inducir a la formación de factores mutagénicos, teratogénicos, cancerígenos o simplemente tóxicos, aunque juicios recientes y autorizados, sugieren que tales afirmaciones eran muy infundadas (Comité de Expertos FAO/OIEA/OMS, 1977).
4. Las dosis utilizadas para destruir microorganismos son varias veces superiores que las precisas para matar a un hombre y por lo tanto deben tomarse medidas de seguridad muy estrictas para proteger a los obreros y a los manipuladores de alimentos. Esto obliga a utilizar una fuerte protección alrededor de la fuente radiactiva y a controlar continuamente al personal y a la zona de trabajo.
La radiación a los niveles de energía utilizados para los alimentos (< 2 MeV) no producen radiactividad inducida.



Sin embargo, puede producirse radiactividad inducida con radiaciones de alta energía que pasen de 10 MeV, lo que resulta impropio para el tratamiento de alimentos. Las radiaciones ionizantes se caracterizan por atravesar instantaneamente la materia estando en relación este dato con la clase de radiación y la densidad del material a tratar. Para una energía determinada, la radiación gamma es mucho más penetrante que los electrones. La radiación ß con energía de 3 MeV tiene una capacidad de penetración en el agua de 1 cm aproximadamente y se comporta de forma semejante en alimentos líquidos o sólidos de una densidad similar, mientras que la radiación y con energía de 1,1 MeV procedente del 60Co penetra en un alimento alrededor de 20 cm pero sin embargo la frena una plancha de plomo de parecido grosor.
Con ambas clases de irradiación, simultáneamente, es posible conseguir una absorción lo suficientemente uniforme para que llegue a todos los puntos de un alimento que sea aproximadamente el doble de grueso. Además, estableciendo una "geometría" adecuada y normalizando las formas, la distribución de la dosis por todas las partes del alimento puede llegar a ser casi uniforme. Cuando el daño molecular tiene lugar en una parte vital de una célula viva, esta célula muere, y existe una gran evidencia que indica que ocurre esto en la alteración del núcleo o el material nuclear. En una pequeña proporción de casos la alteración da lugar a una mutación. Los organismos mayores mueren con dosis de radiación ionizante mucho más pequeñas, por tanto, cuando se utilizan dosis de 100 Krad con objeto de destruir bacterias, la radiación debe actuar de forma que no pueda llegar hasta los operarios.


 
  
La dosis se mide normalmente mediante dosímetros, mientras que la fuente se regula con monitores en cámaras de ionización modificadas. Los dosímetros que se utilizan más corrientemente son cristal de cobalto, sulfato ferroso, o sulfato ceroso. El cristal de cobalto cambia de color proporcionalmente a la dosis que recibe. Las sales ferrosas y cerosas son oxidadas a sales férricas o céricas como resultado de la interacción con radicales hidroxílicos producidos por la radiación del agua.  En un paquete con alimentos expuesto a una fuente de radiación ionizante, la distribución de la dosis no puede ser uniforme. Se encuentra comunmente unas variaciones entre 100 y 125 % y esto se debe conocer anticipadamente para calcular el tratamiento a que tienen que someterse los alimentos. El cálculo de la dosis letal para los microorganismos está en relación con el número de supervivientes y los cálculos matemáticos son en cierto modo similares a los utilizados en el tratamiento térmico.  La muerte de los microorganismos es una consecuencia de la acción ionizante debida a la radiación de alta energía. La mayoría de los estudios indican que una causa primordial de letalidad es la alteración sufrida por el ADN microbiano, lo que da lugar a una pérdida de la capacidad reproductora, pero la alteración de otras moléculas sensibles e importantes (p.e. en las membranas) puede tener lugar también. Las dosis letales para los microorganismos no inactivan a la mayoría de los enzimas, ni tienen lugar cambios importantes en las proteínas y otras moléculas grandes.
Se forman radicales libres y otras moléculas reactivas, particularmente en el agua, aunque no está claro hasta donde llega la ionización primaria ("golpes directos") y hasta donde los efectos secundarios como responsables de las alteraciones letales en los microorganismos. En los alimentos irradiados, la alteración subletal puede impedir la revitalización de ciertas bacterias. Los microorganismos difieren mucho en lo que se relaciona con su sensibilidad a la irradiación.
En sentido general la muerte de microorganismos de poblaciones expuestas a las radiaciones ionizantes es de naturaleza logarítmica. Por tanto, si un cultivo o una suspensión de una cepa pura de un microorganismo se expone a la acción constante de la irradiación ionizante letal, una fracción constante de la población microbiana morirá a intervalos de tiempo iguales, con independencia del número total. En la práctica, esto significa, que un gráfico del logaritmo de los supervivientes frente a las dosis, es una línea recta en casi toda su longitud.  En algunos casos puede aparecer al comienzo de la curva un pequeño "hombro". Esto puede deberse a fenómenos no relacionados con la sensibilidad real a la irradiación de los microorganismos, como puede ser la agrupación de células, o a que existen por lo menos dos zonas sensibles en la célula, las cuales es necesario que se inactiven antes de que dichas células pierdan su viabilidad.
Desde el punto de vista matemático, la situación es semejante a la muerte producida por calentamiento, y el valor D (tiempo de reducción decimal) concepto de los termobacteriológicos, se aplica igualmente a la muerte por irradiación. El valor D, se define como la dosis necesaria para reducir la población microbiana a una décima parte (log 10 1). Luego un tratamiento 2D equivaldría a una dosis suficiente para reducir la población microbiana a la centésima parte.
La resistencia de los microorganismos a los efectos letales de la irradiación, aumenta en ausencia de oxigeno, lo que sugiere que tienen importancia las reacciones de oxidación que se originan como consecuencia de la irradiación. También aumenta la resistencia de los microorganismos a la radiación ionizante en auséncia de agua.  En substratos completamente deshidratados, se requieren dosis 2 a 3 veces más altas para obtener efectos microbicidas equivalentes a las precisas en substratos hidratados, ésto se debe a que se aminora la ionización secundaria, así como también a los efectos de los radicales libres que se citan más adelante. Congelando, con lo que efectivamente se inmovilizan las moléculas de agua, se producen efectos protectores similares, debidos posiblemente a la inmovilización de las moléculas reactivas retenidas por la malla de cristales de hielo hasta que se deshacen. Debe señalarse que el efecto es menor en los esporos, presumiblemente debido al secuestro del agua en la estructura de los mismos.
El sustrato influye en la sensibilldad a la irradiación. Por esto, pueden necesitarse dosis distintas para conseguir efectos microbicidas semejantes en alimentos diferentes. Además, los alimentos pueden producir condiciones anaeróbicas localizadas, incluso cuando el oxígeno está presente en el exterior, y esto puede influir de una forma importante en la resistencia a la irradiación.
La sensibilidad a la radiación de los microorganismos difiere según las especies e incluso según las cepas, aunque las diferencias de resistencias entre cepas de una misma especie son generalmente lo suficientemente pequeñas para no tenerlas en cuenta a efectos prácticos.
Las bacterias gram-negativas, incluyendo los microorganismos causantes de alteración de los alimentos (p.e. Pseudomonas) y las especies entéricas, incluyendo las patógenas (p.e. Salmonella, Shigella), son generalmente más sensibles a la irradiación que las bacterias gram-positivas. El estreptococo fecal es bastante resistente, los esporos bacterianos son todavía más resistentes, y el Micrococcus radiodurans es excepcionalmente resistente.



j. ÁCIDOS ORGÁNICOS

Los ácidos orgánicos y sus ésteres se hallan muy difundidos en la naturaleza. Se encuentran con frecuencia en frutas; por ejemplo, el ácido cítrico de los frutos cítricos, el ácido benzoico en arándanos agrios y las ciruelas verdales, el ácido sorbico en la fruta del fresno (Dukes, 1969; Chichester y Tanner, 1972). El ácido láctico se encuentra en los tejidos animales; el galato de metilo en las hojas de diversos géneros de plantas (Carlson y col., 1951) y en las especias se encuentran varios ácidos orgánicos (Rargreaves y col., 1975).
Muchos de ellos constituyen metabolitos intermediarios y productos finales del metabolismo microbiano y se encuentran en grandes cantidades en muchos productos lácticos, cárnicos y vegetales fermentados. Nuestros antepasados descubrieron que los cambios deseables desarrollados sobre el aroma y la textura de estos productos y la acidez provocada por la formación de ácidos orgánicos constituía un medio valioso para retrasar o evitar la alteración proteolítica. Ello permitió conservar almacenados muchos alimentos perecederos y hacer la dieta más variada. Hoy en día muchos fabricantes utilizan ciertos ácidos orgánicos para ayudar a la conservación de diversos productos. Sin embargo, la concentración y el tipo de ácidos orgánicos permitida son cuidadosamente controlados por los organismos gubernamentales responsables de la Sanidad, y las concentraciones permitidas son generalmente pequeñas, comparadas con las de los ácidos orgánicos en muchas frutas y productos fermentados (FAO/WHO, 1973).

Por su solubilidad, sabor y baja toxicidad los ácidos orgánicos de cadena corta, tales como el acético, benzoico, cítrico, propiónico, y sórbico son muy utilizados como conservadores o acidificantes.
Al considerar la posible utilización como conservadores de otros ácidos orgánicos es conveniente recordar que la actividad antimicrobiana de estos compuestos suele ser superior a medida que se alarga la longitud de su cadena molecular. Sin embargo, los ácidos alifáticos de más de diez u once átomos de carbono poseen muy poca aplicación potencial debido a su muy baja solubilidad en agua. Los métodos de análisis de los ácidos orgánicos en los alimentos se basan generalmente en una destilación en corriente de vapor, o por solventes, seguido de una valoración del tipo y proporción del ácido (o ácidos) en cuestión presentes en el destilado mediante espectrofotometría o cromatografía. Los detalles de los métodos pueden hallarse en la mayor parte de los libros de texto o tratados de análisis químico, como por ejemplo los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC (Horwitz, 1975). La actividad antimicrobiana de un ácido orgánico o su éster se debe a las moléculas no disociadas de este compuesto (lngram y col., 1956; Macris, 1975).
Algunos ácidos orgánicos en su estado no disociado son muy solubles en las membranas celulares (Cramer y Prestegard, 1977). Unicamente los ácidos orgánicos lipófilos muestran actividad antimicrobiana. Según una hipótesis, estos compuestos inhiben el crecimiento de los microorganismos, o los matan, por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento en el transporte de sustratos y en la fosforilización oxidativa del sistema transportador de electrones. Los ácidos orgánicos saturados, como el ácido sórbico y los ésteres del ácido parahidroxihenzoico, también inhiben el sistema de transporte de electrones (Freese y col., 1973).
Este fenómeno da lugar a la acidificación del contenido celular, que es probablemente la principal causa de la inhibición y muerte de los microorganismos. El pKa (pKa = al pH en el cual el 50 % del ácido se halla no disociado) de los ácidos orgánicos empleados como conservadores se halla en el rango de pH de 3,5. Al bajar el pH de un alimento, aumenta la proporción de las moléculas no disociadas de un determinado ácido orgánico, aumentando de esta forma su efectividad como agente antimicrobiano. Estas consideraciones limitan la utilidad de los ácidos orgánicos a aquellos alimentos de pH inferior a 5.5. Los ácidos orgánicos se utilizan principalmente como agentes micostáticos.  Sin embargo, a concentraciones elevadas, resultan muy eficaces frente a diversos microorganismos (incluidos los virus): por ejemplo, cuando sus concentraciones son superiores al 1% en frutas y productos fermentados con microorganismos, o cuando se acidifica hasta pHs de 4,0 o valores inferiores (Dakin, 1957). Los efectos observados en cultivos mixtos o en alimentos almacenados en los que un microorganismo ejerce un efecto sinérgico o antagónico sobre otro, se cree que, en muchos casos, se debe a la formación "in situ" de ácidos orgánicos como productos secundarios del crecimiento microbiano.  La mayor parte de los ácidos orgánicos son muy poco eficaces como inhibidores del crecimiento microbiano a pHs de 5,5-5,8 en los que crecen la totalidad de las bacterias causantes de toximfecciones y la mayor parte de las causantes de alteración. Constituyen una excepción los ésteres del ácido paraludroxibenzoico, con un pKa = 8,5, que muestran actividad antimicrobiana a pHs próximos a la neutralidad, y los ácidos propiónico y sórbico que también poseen cierta actividad a pH = 6,0 ó 6,5 (Chichester y Tanner, 1972).
Existen muchas publicaciones en la literatura científica y muchas patentes que atribuyen un espectro amplio de actividad antimicrobiana a una gran variedad de ácidos orgánicos de cadena recta ramificada, saturados o insaturados. Un cierto número de ácidos orgánicos saturados de cadena más larga son muy eficaces como inhibidores, tanto de las bacterias Gram positivas como Gram negativas, pero la actividad frente a las gram-negatigas cae rapidamente en aquellos con más de ocho átomos de carbono (Sheu y col., 1975).
La refrigeración aumenta la actividad bactericida de los ácidos nonanoicos y decanoicos frente a Eschenchia coli (Fay y Farias, 1976). Los ácidos grasos no saturados de cadena larga son particularmente eficaces contra las células vegetativas de las bacterias Gram-positivas y evitan también la germinación de los esporos de las especies de Bacillus. Los cis-isomeros son más eficaces que los transisomeros y la actividad de un compuesto con determinado tamaño molecular aumenta con el grado de insaturación de la molécula (Kodicek, 1956). Por lo general, la utilización de ácidos orgánicos es compatible con la de otros conservadores o sistemas de conservación y de hecho muchas combinaciones poseen un efecto sinérgico. Por ejemplo, muestran mayor eficacia como inhibidores microbianos a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento y mayor como microbicidas a medida que la temperatura aumenta. (Goepfert y Hicks, 1969; Park y Marth, 1972).

Algunos ejemplos de combinaciones sinérgicas son las siguientes: a) benzoato con anhidrido sulfuroso, anhidrido carbónico, cloruro sódico o sacarosa (Rehin, 1960; Chichester y Tanner 1972); b) propionato con anhidrido carbónico (Windsor y Thoma, 1974); c) sorbato con sacarosa, cloruro sódico o con nisina y polifosfato (Gooding y col., 1955; Ashworth y col., 1974); d) ácido lácfico con ácido acético (Rubin, 1978); e) propionato con sorbato (contra los estafilococos, Preonas y col., 1969); y 1) ácido benzoico y bórico contra los aspergrnus (Rehm, 1960).

Cuando se utilizan tales combinaciones se precisan concentraciones inferiores de cada uno de los componentes para obtener el mismo efecto protector. La eficacia de los ácidos orgánicos como agentes antimicrobianos se mejora, generalmente, por los aniones que interfieren con la disociación de la molécula de ácido. Determinados cationes pueden también aumentar de una manera significativa la eficacia de los ácidos orgánicos aumentando la solubilidad del ácido en la membrana de la célula microbiana (Larsson y col., 1975). Algunos microorganismos parecen poseer un sistema de transporte de ácidos orgánicos desde la célula, que es inducible y funciona mediante un aporte energético, lo que permite su crecimiento en presencia de elevadas concentraciones de ácidos (Warth, 1977).
La formación de peróxidos y otros productos resultantes de la oxidación de los ácidos grasos puede aumentar la eficacia antimicrobiana de ciertos ácidos grasos insaturados (Lamprecht y Elliott, 1974; Tonge, 1964). Sin embargo, los ácidos orgánicos, al igual que la mayor parte de inhibidores microbianos, suelen ser más eficaces en condiciones anaeróbicas, que aeróbicas (B. Freame y S. Warren, 1976 comunicación personal).
Existen varias limitaciones al valor como inhibidores microbianos de los ácidos orgánicos en los alimentos:

1. Suelen resultar ineficaces cuando los niveles iniciales de microorganismos son elevados.
2. Muchos microorganismos utilizan los ácidos orgánicos como fuente metabolizable de productos carbonados.
3. Existe una variabilidad inherente en cuanto a la resistencia de determinadas cepas.
4. En determinadas condiciones de utilización, pueden resultar seleccionados tipos de microorganismos resistentes (Ingram, 1960;York y Vaugltn, 1954).

El ácido acético y sus sales son muy eficaces como acidificantes y conservadores y son muy utilizados para estos propósitos. Unicamente los Ácetobacter sp., algunas bacterias lácticas y algunos mohos y levaduras muestran cierto grado de resistencia a este compuesto (Dakin, 1957). La presencia de 1-2 % de ácido acético no disociado en carne, pescado, o vegetales suele inhibir o matar todos los microorganismos presentes, aunque, en condiciones normales de utilización, especialmente en malas condiciones higiénicas, pueden sobrevivir los microorganismos más acidotolerantes. Esta concentración de ácido puede reducirse significativamente si se trata de productos refrigerados o con una elevada concentración de sal o azucar (Beil y Etchells, 1952). El crecimiento de la mayor parte de las bacterias causantes de toxiinfecciones y de las esporulantes, se inhibe con concentraciones de 0,1 %, y el de los mohos micotoxigénicosa concentraciones de 0,3 %.
El ácido benzoico se usa esencialmente como agente micostático. Muchas levaduras y mohos se inhiben a concentraciones de 0,05 – 0,1% de ácido no disociado. Las bacterias esporulantes y causantes de toxi-infecciones se inhiben generalmente con concentraciones de 0,01-0,02 % pero la mayor parte de las bacterias causantes de alteraciones son mucho más resistentes y no debe, por tanto, confiarse en el ácido benzoico para la conservación de los alimentos capaces de permitir el crecimiento bacteriano.
Los ácidos cítrico y láctico, tienen por lo general, solamente una actividad antimicrobiana moderada y excepto a bajos valores de pH, no resultan eficaces como inhibidores. Sin embargo, una concentración de ácido cítrico no disociado de 0,001 % inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus en condiciones anaeróbicas (S. Warren, 1976, comunicación personal). Tanto el ácido cítrico como el láctico parecen inhibir específicamente la formación de aflatoxinas y sterigmatocystina (Reiss, 1976).



k. ANTIBIOTICOS Y ALIMENTOS
Los antibióticos, producidos por microorganismos o sintéticamente, inhiben a los microorganismos a grandes diluciones. Los antibióticos como "medicamentos maravillosos" para combatir las enfermedades del hombre y de los animales no se estudiarán aquí. Durante cierto tiempo se emplearon en los alimentos para inhibir las bacterias alterantes, pero por causas diversas que se estudiarán en este capítulo los organismos encargados del control alimenticio prohiben ahora su adición a los alimentos. Incluso los pequenos residuos existentes en los alimentos procedentes de los animales tratados con antibióticos se consideran actualmente inaceptables.
Los microorganismos de los alimentos pueden convertirse en antibiótico resistentes y colonizar el intestino del hombre y de los animales; sus residuos pueden asimismo ejercer una acción selectiva favoreciendo a la flora resistente ya existente en el intestino; en estas condiciones los antibióticos empleados terapéuticamente pueden resultar ineficaces.

Una de las más importantes razones de la persistencia de bacterias resistentes es el empleo indiscriminado de medicamentos antimicrobianos en el hombre y en el ganado (WHO, 1976). Los microorganismos antibiótico resistentes carecen de interés en los alimentos procesados térmicamente, debido a que, en general, hay que esperar que se destruyan durante el tratamiento; sin embargo, pueden encontrarse en los alimentos crudos y llevar a cabo la contaminación de otros alimentos.  Como consecuencia del gran éxito terapéutico de los antibióticos en las enfermedades bacterianas, era natural que se ensayasen como conservadores frente al deterioro microbiano de los alimentos. Estos ensayos se realizaron entre 1945 y 1960 y la mayoría de los antibióticos se comprobaron en múltiples alimentos perecederos de todas las formas imaginables.
A medida que fue aumentando el miedo a los microorganismos antibióticoresistentes fue disminuyendo el empleo de los antibióticos como conservadores de los alimentos. Además en las industrias que procesaban carne de aves Ng y col (1957) y Walker y Ayres (1958) observaron el desarrollo de bacterias resistentes a los antibióticos corrientemente utilizados; se seleccionaron facilmente microorganismos alterantes muy antibiótico-resistentes (Vaughn y col., 1960). Por lo tanto se vio muy pronto que el empleo corriente de antibióticos como conservadores alimenticios podía convertirlos en ineficaces debido a que se habían seleccionado floras alterantes antibiótico-resistentes.
Los dos antibióticos más importantes empleados en muchos países con fines conservadores alimenticios son la natamicina y la nisina, ninguno de los cuales se utiliza en terapéutica. La tilosina (un antibiótico macrólido), entre los antibióticos poco resistentes se emplea todavía como aditivo de los piensos.
Este antibiótico ocupa una posición intermedia ya que se utiliza algo, principalmente en Japón, como conservador alimenticio (Amano y col., 1968). Su empleo al parecer, ha sido abandonado. La natamicina es un antibiótico macrólido originado por Streptomyces natalensis; su prmcipal efecto es antifungico y su empleo está perrnitido en ciertos países (WHO, 1969, 1976). In vitro inhibe el desarrollo de hongos productores de aflatoxinas en los cacahuetes crudos triturados (Gelda y col., 1974). Ello constituye una ventaja considerable, lo que para algunos expertos seria suficiente para superar cualquier objeción acerca del empleo de este antibiótico en los alimentos.
Hay varias publicaciones sobre el empleo de la natamicina para inhibir el desarrollo fúngico de los embutidos. Por ejemplo, con concentraciones de natamicina de unas 1000 ppm se conservaron bien, sin sufrir ataques fúngicos, embutidos holandeses. El antibiótico puede aplicarse con salmuera, baños o en forma de "spray" y el embutido puede incluirse en diferentes tipos de tripas.

Este tratamiento determinó una concentración superficial de 2 ppm/cm2 que se consideró que no tenía importancia toxicológica (Moerman, 1972). Probablemente la aplicación más importante de la natamicina es para tratar la corteza del queso, tanto blando como duro, mediante la sumersión de aquél en baños, o rociandolo con suspensiones de 500 ppm de natamicina. El antibiótico puede detectarse en la corteza; su penetración varía de acuerdo con el tipo de queso (Gripon y Bergére, 1973). También se ha empleado la natamicina en las películas de envolver queso; su efecto conservador se pierde si se aplica después de desarrollado el micelio. Ciertos mohos, (p. ej. Áspergillus flavus) producen enzimas en cantidad que inactivan la natamicina (*Natamicina es el nombre internacional, no registrado, del antibiótico llamado antes ricina. Los antibióticos macrolidos contienen un anillo grande de lactona, pocos dobles enlaces, ningún atomo de nitrógeno y en el anillo uno o más restos azucarados.).  La nisina es un antibiótico originado por estirpes de la bacteria que normalmente corta la leche, el Streptococcus lactis; se presenta naturalmente en la leche ácida y en el queso de granja por lo que es muy posible que desde que se domesticaron las vacas se hayan ingerido pequeñas cantidades de este antibiótico.
El empleo de la nisina como conservador alimentario se ha estudiado con profundidad y se ha revisado la mayoría de la bibliografía sobre el tema (Hurst, 1972; Jarvis y Morisetti, 1969). La nisina no se emplea ni en los piensos, ni en medicina humana o veterinaria; los microorganismos que desarrollan resistencia frente a este antibiótico se ignora si son resistentes a otros.
La nisina es un polipéptido que lo inactivan fácilmente los enzimas proteolíticos a pH = 8, por lo que es fácilmente digerido; estudios extensos realizados con ratas a las que se suministró per os durante dos años hasta 8 mg/kg de peso no manifestaron toxicidad alguna.
El empleo de la nisina como conservador de alimentos "debería considerarse aceptable siendo la ingesta media diaria incondicional de 0 – 33.000 U/Kg de peso" (WHO, 1969). (Hay unos 40.000.000 de unidades por g de nisina pura; para la conservación de alimentos se recomiendan de 100 a 400 unidades por gramo de alimento (ó 2,5 – 10 ppm). Actualmente se elabora nisina en la URSS, Polonia y Reino Unido (Gudkov y col., 1973) y su empleo está permitido en unos 20 países. (Fowler y McCann, 1972).
La nisina posee un pequeño espectro antibacteriano afectando sólo a los gérmenes gram positivos. Puesto que las bacterias gram negativas no son afectadas el empleo de la nisina como conservador de alimentos no puede contrarresar a una mala higiene; su escaso espectro antibacteriano y su estabilidad ácida determinan unas condiciones de aplicación especiales. Sólo puede emplearse eficientemente cuando los microorganismos alterantes nisina sensibles son prácticamente los únicos presentes en el alimento. Este es el caso por ejemplo, de los clostridios que originan hinchamiento en el queso suizo.
No obstante y por otras razones, este proceso apenas se utiliza en la práctica; el antibiótico es también termoestable especialmente en condiciones de acidez; de aquí que la nisina se pueda emplear como adyuvante del tratamiento térmico. El calor aplicado puede reducirse a sólo el necesario para destruir Clostridium botulinum que es el anaerobio esporulado más nisin-resistentes. Este menor tratamiento térmico mejora la calidad del producto alimenticio; además estos productos presentan mejores condiciones de almacenamiento, especialmente a temperaturas ambientales altas. En el proceso combinado calor-nisina, esta evita el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico. Sin embargo a las concentraciones corrientemente utilizadas, 100 U/g, la nisina no parece que sea esporicida; por lo tanto, el proceso debe planificarse de forma que quede suficiente cantidad de nisina después del tratamiento térmico y durante el almacenamiento para asegurar la continúa inhibición del crecimiento de las esporas.
Cuando la legislación lo permite la nisina no sólo se emplea para prevenir el abombamiento de los botes sino también para conservar el queso procesado y el chocolate con leche. Otras industrias alimenticias la emplean para conservar guisantes, alubias en salsa y "capsuts".




La práctica corriente de incluir antibióticos en la ración de los animales domésticos siguió a la publicación de un trabajo de Stokstad y Jukes (1950) quienes observaron que la aureomicina suministrada en dosis pequeñas aumentaba el ritmo de crecimiento. El aumento consiguiente de la producción de alimentos suponía del 4 al 10 % dependiendo de una serie de factores. El suministro de antibióticos ha permitido también el desarrollo de unas condiciones de cría intensivas y superpobladas que caracterizan a las modernas técnicas de explotación animal (Kiser y col., 1961).  Pronto se puso de manifiesto la preocupación por el desarrollo de resistencia de la microflora de los animales a los que se suministraban antibióticos. Jukes (1973) revisó el efecto de los antibióticos 23 años después de su introducción casi rutinaria en los piensos y no encontró pruebas de toxicidad ni para los animales domésticos ni para el hombre. La ganancia en peso vivo atribuible a los bajos niveles de antibióticos suministrados con el pienso durante periodos grandes de tiempo no ha variado.
No obstante, el aumento de la incidencia de microorganismos antibiótico-resistentes ha causado preocupación. La existencia de microbios resistentes se conoce desde el trabajo pionero de Paul Erlich a comienzos de siglo; pensó que estas bacterias se convertían en resistentes por una mutación cromosómica espontánea o por la selección, en presencia del agente quimico terapéutico, de las bacterias resistentes ya existentes en la población microbiana. La resistencia de tipo cromosómico es específica de un grupo de antibióticos relacionados entre sí.
Un nuevo desarrollo en la historia de la resistencia bacteriana fue el descubrimiento de los investigadores japoneses de resistencia múltiple a fines de los arios 1950; las bacterias pueden convertirse en resistentes simultáneamente a varios grupos de antibióticos no relacionados entre sí (véanse las revisiones de Watanabe, 1963 y Falkow, 1975). La resistencia múltiple se adquiere por transferencia desde un microorganismo resistente a otro sensible, de un elemento genético, llamado plásmido; existe independientemente del cromosoma bacteriano y en un mismo microorganismo puede haber uno o varios tipos diferentes de plásmidos. El relacionado con la antibiótico – resistencia microbiana se ha llamado también factor de resistencia (factor R) y la bacteria que lo posee suele de-nominarse R+.
Los plásmidos, como los cromosomas, se componen de moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA); los plásmidos R más grandes representan el 1 – 2 % de la información genética total de las bacterias. La transferencia puede tener lugar entre miembros de especies distintas; por ello los factores R son especialmente importantes en las enterobacterias en las que existe la posibilidad de que se transfiera antibiótico resistencia de un Escherichia coli no patógeno a una Salmonella patógena.
Todos los géneros de enterobacterias pueden contener factores R. También poseen plásmidos de resistencia las pseudomonas y los estafilococos y estreptococos. Es posible que tal transferencia de factores R ocurra en condiciones naturales entre las bacterias que pertenecen a la misma familia. Se admite ahora generalmente que la mayoría de las "resistencias" de las bacterias de tipo salvaje se deben a factores R y no son del tipo cromosómico.  El concepto que de ello emerge es el de un sistema ecológico común al hombre y animales. Los recientes trabajos de Levy y col., (1976a,b) confirman ampliamente estas sospechas. Los problemas de transferencia de factores R de las bacterias patógenas a las inócuas y el consiguiente miedo a que falle la terapéutica antibiótica humana, especialmente en el caso de resistencia antibiótica múltiple ha llevado al establecimiento de comisiones de encuesta.
Quizá las más importantes sean el Comité Swabb (Anónimo, 1969) del Reino Unido y la Task Force de la Administración de Alimentos y Medicamentos (departamento de Salud, Educación y Bienestar de los EEUU. FDA., US. Department offlealth, Education and Welfare, 1972). En general ambas comisiones estudian el problema bajo los mismos puntos de vista, pero las recomendaciones y la legislación de ambos países difieren apreciablemente.
Ni el comité Swann, ni la Task Force encontraron pruebas que demostrasen que los residuos de antibióticos de los productos originados por animales que habían recibido con el pienso cantidades subterapéuticas de antibióticos fuesen tóxicos para el consumidor. Además tampoco pudieron comprobar que tales productos contribuyesen a las reacciones alérgicas de personas que se hubieran sensibilizado previamente a los mismos.  De otra parte ambas comisiones se mostraron preocupadas porque las formas antibiótico-resistentes de las bacterias patógenas del hombre pudieran presentarse en los animales y de éstos pasar a la especie humana. Un informe de la OMS (World Health Organizacion, 1973) hace énfasis en que los beneficios del suministro de concentraciones bajas de antibióticos son demasiado grandes como para considerar su retirada del empleo ganadero.  No obstante, dado que los antibióticos son indispensables para la terapéutica humana y animal, el citado informe los ha ordenado de acuerdo con su mayor peligro.
Aquellos que presentan menos peligro son adecuados para su utilización con el pienso, mientras los que presentan gran riesgo no son aptos para este fin. A continuación se clasifican los antibióticos empleados con fines terapéuticos, profilácticos o alimenticios en orden creciente de peligrosidad respecto al desarrollo de resistencia bacteriana:

1. Bacitracina, flavofosfolipo* (*Este es el nombre no registrado de un antibiótico cuya denominación comercial registrada es la de flavomicina), virgmiamicina.
2. Polimixina, furanos, lincomicina, tilosina y macrólidos relacionados con ellos.
3. Eritromicina, espiramicina, oleandomicina.
4. Penicilina, tetraciclinas.
5. Ampicilina, cefalosporinas.
6. Sulfonamidas, estreptomicina, neomicina.
7. Cloranfenicol.



La Comunidad Económica Europea (CEE) reconoció en la década de 1960 el riesgo de suministrar antibióticos que pudieran seleccionar los microorganismos resistentes que albergan plásmidos y desaconsejó el empleo como aditivos del pienso de tetraciclinas, estreptomicina y antibióticos relacionados con ellas. Se prohibió el empleo de la penicilina por el amplio uso que se hace de este antibiótico en medicina humana y animal. En la CEE nunca se han utilizado con fines nutritivos el cloranfenicol, polimixina, ampicilina, cefalosporinas, ni sulfamidas; sin embargo, algunas de éstas siguen utilizandose como coccidiostático en avicultura. Continuan los comentarios sobre si el empleo de los macrólidos, incluida la lincomicina, debería prohibirse en terapéutica animal y en los piensos; algunos antibióticos pueden excluirse de su empleo animal.
Varias investigaciones han demostrado que en las personas sanas hay una alta incidencia de E. coli R+. Datta (1969) encontró positivas el 52 % de muestras fecales; Moorhouse (1969) vio que el 71 % de muestras de niños sanos menores de 2 años eran positivas. Hasta el 10 % de los E. coli aislados de aguas cloacales en el Reino Unido eran R+ (Smith, 1971).

Encuestas para investigar la presencia de organismos con resistencia múltiple (p. ej., Salmonella) en paises en los que rara vez se practica la adición de antibióticos a los piensos, si es que alguna vez se llevó a cabo, demostraron también la presencia natural de tales microbios (por ejemplo, Lafalx y col., 1969 en Senegal). Al compara el contenido intestinal de E. coli R+ de los carnívoros y vegetarianos, no se encontraron diferencias entre ambos grupos (Guinée y col., 1970).
Muchas personas que nunca se han tratado con antibióticos poseen Escherichia Coli aparentemente estable (Anderson y col., 1973). Anderson y col., (1975) senalaron que los plásmidos autotransferibles aislados de las enterobacterias del hombre y de los animales presentaban DNA con una gran homología, demostrando que estos plásmidos eran identicos en todos sus aspectos importantes.


l. ENVASES Y ENVASADO DE LOS ALIMENTOS

El envasado preserva la calidad de los alimentos y los protege de los daños que pudieran producirse durante el almacenamiento, el transporte y la distribución. La protección ejercida puede ser de tres tipos:

1. Química. El envasado puede impedir el paso del vapor de agua, del oxígeno y de otros gases, o actuar de forma selectiva, permitiendo sólo el pasó de algunos de los gases.
2. Física. El envasado puede proteger de la luz, el polvo y la suciedad, de las pérdidas de peso y de los daños mecanicos.
3. Biológica. El envasado puede impedir el acceso al alimento de microorganismos e insectos, afectar el modo o velocidad de la alteración, o la supervivencia y crecimiento de los gérmenes patógenos que pudiera haber en el alimento.



Los envases pueden ser rígidos (latas, papel, cartón, vidrio, plástico) o flexibles (plásticos, hoja de aluminio). Los plásticos son cada vez más utilizados (Effenberger y Schotte, 1971; Briston, 1971, 1976). Mediante diversas combinaciones de materiales y técnicas de procesado, es posible producir envases con cualquiera de las propiedades funcionales que se consideren deseables.
Los componentes e impurezas de los materiales de envasado y sus adhesivos, no deben poner en peligro la salud humana (Bergner, 1962) ni reaccionar con el alimento o adulterarlo.
El material de envasado no debe contener microorganismos patógenos que puedan introducir un riesgo para el consumidor. Por ejemplo, la presencia de salmonellas en un material de envasado que vaya a usarse para un plato precocinado y congelado, sería inaceptable.  Sin embargo, no habría razón para preocuparse excesivamente por la presencia de unos cuantos esporos de Clotridium perfringens en el material utilizado para envasar especias deshidratadas, porque de cualquier manera, es fácil que existan esos mismos esporos en la misma especie. Tampoco debe el material de envasado introducir cantidades importantes de microorganismos causantes de alteracion.  Se ha desarrollado un procedimiento que mediante un sencillo chorro de vapor, sirve para descontaminar los recipientes empleados para cocer jamones (Lerche y col., 1957). Muchos países imponen standards microbiológicos para controlar la contaminación superficial de botellas y otros recipientes reutilizabIes (Cousins, 1976); una contaminación superficial de sólo 10 microorganismos por 100 cm2 equivale a "muy limpio" (von Bockeimann, 1975).

En papel sin tratar, se ha podido observar que predomina el género Bacillus y a veces los micrococos, a niveles normalmente inferiores a los 200/gramos, aunque aveces se llega hasta 2800/g (von Bockelmann y von Bockelmann, 1974); en otro estudio similar, se encontraron mohos y levaduras a niveles de hasta 10 por 100 cm2 (Achtzehn, 1964). En Estados Unidos, el papel para envasado de alimentos no debe sobrepasar los 250 organismos por gramo y los recipientes y tapas para leche, no más de uno por cm2 (U .S. Department of Health, Education and Welfare, 1966). Se ha propuesto un método standard (Anónimo, 1974a) para la determinación del recuento de bacterias, mohos, levaduras y gérmenes coliformes en materiales de envasado no absorbentes.
Los niveles de bacterias en la superficie de hojas de aluminio utilizadas para el envasado de alimentos, son aun menores. Los tubos y películas de plástico suelen tener entre 1 y 20 microorganismos por cada 1000 cm2 y normalmente no llegan a los 10. En los vasitos de plástico, los valores encontrados son del mismo orden (Hartman y col., 1963). Sin embargo, algunos microorganismos sobreviven incluso a la extrusión a 220ºC de los plásticos (Placzek y Witter, 1972; Voss y Moltz en, 1973). A veces, se presta demasiada importancia a la contaminación microbiana aportada por el material de envasado; en general, los niveles de microorganismos contenidos en el producto son varios órdenes de magnitud mayores de los que existen en el material de envasado. (Yanai y col., 1969). 

Al no poder ser degradados por la acción microbiana, el poliestireno y otros plásticos, son más higiénicos que el papel prensado u otros derivados de la madera para el envasado de huevos (Pfeiffer,1972), carne (Bólime, 1971) o frutos en baya (Ayres y Denisen, 1958). Algunos plásticos tienen propiedades antibacterianas; es el caso de los que contienen alquido-bamices, resinas fenólicas, cloruro de polivirlilo o poliacetal (Gundermann y Glück, 1971). Sin embargo, antes de escoger un material de envasado por sus propiedades antimicrobianas, conviene asegurarse de que no va a adulterar el alimento.
El material de envasado debe impedir la entrada de los microorganismos; las botellas, latas y la mayoría de las películas de plástico actualmente en el mercado, cumplen esta función (Ronsivalli y col., 1966). Se produce penetración cuando falla el sellado o se perfora el envase; por eso, el material ha de tener la suficiente resistencia mecánica como para impedir que se produzcan daños durante el procesado y la manipulación posterior. El mismo contenido puede también dañar el envase: es el caso de los huesos afilados de aves y otras cames, y de las fibras de músculo o trozos de piel en alimentos muy desecados o ahumados.
Una prueba biológica es lo mejor de determinar si una película resistirá a la penetración; se sumerge una porción estéril de un medio nutritivo empaquetada con el material en cuestión y sellada, en un baño que contenga el microorganismo concreto que interese (por ejemplo, Enterobacter) o una mezcla de microorganismos.



La presencia de gas o la turbidez en el medio indicará que se ha producido penetración (Kleniewski, 1970; Maunder y col., 1968; Ronsivalli y col., 1966). Para el ensayo de laminados de plástico y aluminio resistentes al calor, Schmidt-Lorenz (1973) ha recomendado la "prueba de ebullición en agar", en la que los envases se hierven durante 45 minutos en agar al 2 %. Antes de que se enfríe el agar, se añaden esporos de Bacillus stearothermophilus y durante el enfriado, el medio inoculado pasa a través de los puntos de penetración.  Varios autores han demostrado que algunos microorganismos pueden atacar los materiales de envasado sintéticos y, en condiciones favorables, pueden atravesar una película no dañada previamente (Schwartz, 1964, Booth y col., 1968; Hartman y col., 1963; Ronsivalli y col., 1966;Toepfer y Kanz, 1976). En algunos casos, se requiere una exposición prolongada a los enzimas bacterianos para que sea posible la entrada.
Por ejemplo, los microorganismos productores de celulasa, sobre todo los mohos, no atraviesan las tripas de hidrato de celulosa de los embutidos, mas que al cabo de mucho tiempo a temperaturas relativamente altas (Leistner, 1956). Las películas de plástico tienen muy variada permeabilidad a los gases. La exclusión del oxígeno disminuye la velocidad de oxidación del producto, hace más lento el crecimiento de muchos tipos de bacterias y levaduras e impide el crecimiento de los microorganismos aerobios estrictos (como los mohos, por ejemplo). La alta permeabilidad al oxígeno del poliestireno y las poliolefinas, puede ser reducida combinando estos polímeros con otros materiales mediante barnizado, encolado, recubrimiento o superposición con una capa del otro material o por coextrusión de ambos materiales. de forma análoga, se puede reducir la permeabilidad al vapor de agua de un material; la alta permeabilidad del hidrato de celulosa, por ejemplo, puede reducirse mediante barnizado.
El factor más importante de la microbiología de los alimentos envasados es la permeabilidad relativa del material de envasado para el oxigeno, el dióxido de carbono y el vapor de agua, particularmente si los espacios con aire en el producto original han sido evacuados o rellenados con gases preservantes en el momento de cerrar el envase, y sobre todo, si se trata de productos perecederos, tales como aves, carnes y pescados (Cavett, 1968).
Los envoltorios permeables al vapor de agua y a los gases, o más permeables al oxígeno que al dióxido de carbono y aquellos que no se ajustan a la superficie del producto, pueden evitar la entrada de microorganismos contaminantes, pero no afectan al crecimiento de los microorganismos que previamente se encontraban en el alimento. Las condiciones intrínsecas de un alimento envuelto en un material muy permeable, son similares a las del producto sin envolver (McDougall, 1971). Por ejemplo, las películas de celulosa permeables al oxígeno no impiden que crezcan las Pseudomonas en la carne picada, mientras que las películas impermeables a los gases lo hacen imposible (Jaye y col., 1962). Las películas de materiales que como el politeno, son impermeables a la humedad y permeables al oxígeno, sirven para proteger de la contaminación y de las pérdidas de agua, pero más que frenar, estimulan el crecimiento en superficie de la flora normalmente causante de alteración (McDougall, 1971). El crecimiento y la actividad de los microorganismos dentro de un envase depende de: a) la idoneidad del alimento como medio de cultivo, b) la temperatura, c) la aw, d) el pH, e) la naturaleza de los gases retenidos dentro del envase y f) la competencia entre microorganismos. 

ll. LOS GASES COMO CONSERVADORES

Desde hace muchos años se sabe que diversos gases y vapores naturales, o artificialmente producidos, destruyen o inhiben a los microorganismos. Algunos de ellos se han estudiado para conocer su capacidad potencial de aumentar la vida útil de los alimentos. De estos, sólo se discutirán con detalle los que se han utilizado comercialmente: dióxido de carbono, óxido de etileno, óxido de propileno, dióxido de azufre y ozono. El nitrógeno y el oxígeno se utilizan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de alimentos pero su fin primario no es la inhibición de los microorganismos. El nitrógeno líquido, cuando se utiliza en los alimentos como un agente frigorífico, inhibe o destruye indirectamente a los microorganismos por congelación o refrigeración.




El oxígeno se utiliza en atmósferas controladas para mantener el estado fisiológico de las frutas, hortalizas y verduras (Smith, 1959, 1963) y el caracteristico color rojo de la carne fresca (Clark y Lenta, 1973; Georgala y Davidson, 1970) pero no se aplica con el fin de inhibir los microorganismos responsables de la alteración. Diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con éxito en la desinfección de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo pero no se han aplicado a los alimentos. Entre ellos están la ß – propiolactona, la clorpicrina, el glicilaldehído, el glutaraldehido y el ácido peracético. Aunque el bromuro de metilo se ha utilizado eficazmente, como fumigante, en las frutas y granos infestados por insectos, no se ha empleado específicamente para controlar los microorganismos en los alimentos.
El formaldehido se ha utilizado como fumigante en la desinfección de gallineros (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, 1970) y huevos para incubadoras (Graves y MacLaury; 1962; Ministri of Agriculture, Fisheries and Food, 1971) pero igualmente no directamente para el control de los microorganismos en los alimentos. El formaldehido realmente ejerce una acción letal sobre los microorganismos de la carne y del pescado durante el ahumado pero como el calor y la desecación están también implicados en el proceso, su contribución real a la inhibición de los microorganismos es desconocida. Investigaciones recientes han mostrado que el monóxido de carbono y el acetaldehído son potencialmente útiles para su uso en los alimentos. Un uno por ciento de monóxido de carbono prolonga el color de la carne fresca y tiene un efecto inhibidor sobre las bacterias psicrotrofas, similar al del dióxido de carbono (Clark y col., 1976).
Los vapores de acetaldehído al 0,5 % en la atmósfera inhiben, de una forma acusada, los mohos y levaduras aumentando el tiempo de conservación de las frutas, hortalizas y verduras (Aharoni y Stadelbacher, 1973; Barkai-Golan y Aharoni, 1976).
El dióxido de carbono, gas a las temperaturas normales de almacenamiento, es incoloro, inodoro e incombustible. No es tóxico para el hombre a concentraciones inferiores a un 10 % pero por encima de este nivel una exposición prolongada a la acción del mismo da lugar a la pérdida del sentido, lo que es importante tener en cuenta cuando se utilice a altas concentraciones en los grandes almacenes y vehículos de transporte. No deja residuos tóxicos ni su aplicación presenta serios problemas mecánicos.
El gas se comercializa habitualmente, en forma líquida, en bombonas de acero a una presión de 58 Kg/cm2 (830 lb/pulgada2) aproximadamente o en forma sólida como nieve carbónica. A presión atmosférica, la forma sólida se transforma en gas sin pasar por el estado líquido, sublimándose a -78,5ºC a la presión normal. Para la manipulación de la nieve carbónica deben utilizarse guantes ya que el contacto momentáneo con la piel a -78,5ºC puede causar quemaduras por congelacion y ampollas.





El dióxido de carbono se disuelve bien en agua (1,71 ml CO2/ml H2O a 760 mm de presión y a 0ºC) y, por tanto, en los zumos de frutas pero la absorción parece ser un fenómeno totalmente físico que implica una unión no más intensa que la del ácido carbónico. Cuando se absorbe en los alimentos, el pH baja de acuerdo con la cantidad de ácido carbónico que se forma y con la capacidad tampón del alimento pero de nuevo aumenta cuando el CO2 se elimina por exposición al aire o por un calentamiento suave del producto (Killeffer, 1930). El dióxido de carbono destruye (Coyne, 1932; Killeffer, 1930), estimula (Valley y Rettger, 1927; Gladstone y col., 1935), inhibe (Frankel, 1889; Valley, 1928; Clark y lenta, 1969) o no tiene efecto alguno de resaltar sobre los microorganismos (Parekh y Solberg, 1970), dependiendo de los microorganismos, de la concentración de dióxido de carbono, de la temperatura de incubación, de la edad de las células microbianas en el momento de aplicar el CO2 y de la actividad de agua del alimento o medio de cultivo. De todos estos efectos, los de mayor importancia en relación con el procesado y conservación de los alimentos son, sin duda, los destructivos e inhibidores.
Existe una cónsiderable variación en lo referente a la sensibilidad al CO2 a nivel de género, especie y cepa. Por ejemplo, el CO2 al 100 % destruye totalmente, tras una exposición de 4 días a temperatura ambiente, a algunos cultivos de Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium y Micrococcus (Coyne, 1932) mientras el efecto es nulo o escaso sobre Proteus spp. (Haines, 1933), Clostridium perfringens (Parekh y Solberg, 1970) y algunos tipos de Lactobacillus (Ogilvy y Ayres, 1953). Por tanto, aunque la acción del CO2 sobre los microorganismos es selectiva, la mayoría de las levaduras, mohos y algunas bacterias son inhibidos por concentraciones comprendidas entre 5 y 50 % (viven la fase gaseosa) pero no son destruidos o inhibidos totalmente. Concentraciones inferiores a aquellas no tienen efecto alguno o realmente estimulan el crecimiento (Valley y Rettger, 1927). La inhibición aumenta de una forma casi lineal cuando se incrementa la concentración de CO2 desde un 5 % hasta el 25 - 50 %, dependiendo siempre del alimento y de la flora implicada (Ogilvy y Ayres, 195 la). A concentraciones superiores a ésta el incremento de la inhibición es escaso o nulo (Ogilvy y Ayres, 1951a, 1953; Clark y Lentz, 1969).
Aunque el grado de inhibición varía con los microorganismos y el alimento, con un 10 % se logra habitualmente una inhibición del orden del 50 % sobre la base del recuento total después de un deterrrinado tiempo de incubación (Ledward y col., 1971; Clark y Lentz, 1969).
El efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos en los alimentos parece mayor a medida que disminuye la temperatura de almacenamiento (Coyne, 1933) según se deduce del aumento relativo de la vida útil del alimento al descender la temperatura de almacenamiento. Sin embargo, cuando los efectos de la temperatura y del CO2 se estudian por separado, se observa que la acción del CO2 se incrementa al aumentar la temperatura (Clark y Lentz, 1969). El efecto inhibidor del CO2 se manifiesta, tanto en las bacterias como en los hongos, por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generación durante la fase logarítmica (Brown, 1922; Tomkins, 1932). No obstante, a concentraciones comprendidas entre el 5 y el 20 %, el efecto mayor se logra en la fase de latencia. La aplicación de gas una vez que las células microbianas ha empezado a adaptarse al medio, o cuando ya están en la fase logarítmica, el efecto del CO2 se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en estudios realizados con cepas psicrotrofas del género Pseudomonas y del grupo Acinetobacter – Moraxella (Clark y Lentz, 1969) se comprobó que si se retrasa la aplicación del CO2 (20 %) hasta 1 ó 2 días después de la inoculación sobre la superficie de la carne, el efecto inhibidor es menor. Sin embargo, si la concentración de CO2 era del 40 % el momento en que se expone el producto a la atmósfera de CO2 tiene una influencia menor.
La velocidad de crecimiento en atmósfera de CO2 no aumenta con el tiempo, es decir, la inclinación de la curva de crecimiento no cambia (King y Nagel, 1967). Esto indica que el sistema metabólico no se adapta durante la fase de exposición al CO2 ni existe, en este caso, una selección de los microorganismos CO2 -resistentes. La reducción de la actividad de agua del medio aumenta el efecto inhibidor del CO2 sobre los microorganismos (Scott, 1957). El mecanismo de inhibición de los microorganismos por el CO2 no se conoce todavía con claridad. Sin embargo, ya en 1889 se observó que se debía a la presencia real de dióxido de carbono y no a la ausencia de oxígeno y que el efecto es reversible, ya que los microorganismos tratados recuperan la velocidad de crecimiento normal cuando se dejan de exponer a la atmósfera de CO2 (Fránkel, 1889). No obstante, en el caso de los microorganismos que alteran la carne, permanecen efectos inhibidores residuales cuando el gas se ha dejado de aplicar (Sillikery col., 1977).
El efecto directo del gas sobre las células microbianas se confirmó muchos años más tarde en experimentos realizados con Pseudomonas aeruginosa (King y Nagel, 1967). El descenso del pH debido a la formación de ácido carbónico en el medio tiene un efecto perjudicial sobre ciertos microorganismos; por ejemplo, una atmósfera de CO2 al 20 % puede hacer bajar el pH, si el medio no está tamponado, en un valor de hasta una unidad de pH (de 6,9 a 5,8 Tomkins, 1932).  Sin embargo, los experimentos con medios tamponados (King y Nagel, 1967) y con alimentos intrínsecamente tamponados como la carne han mostrado que el pH externo a la célula microbiana no explica totalmente el efecto adverso del CO2.