1.
FUNDAMENTOS
Esta tinción fue desarrollada empíricamente por el médico danés Hans
Christian Joachim Gram en 1884.
A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha
modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier
identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes
grupos de eubacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-).
En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la
microbiología, es fundamental la observación de los microorganismos. Esta
observación se hace necesaria para su clasificación e identificación. Para ello
se usa el microscopio tanto óptico como electrónico, y en sus diversas
variantes (microscopio de rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de
fase, de campo oscuro…). Nosotros abordaremos únicamente el microscopio óptico
compuesto de dos lentes (condensador y objetivo).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos,
pero en microbiología se usa preferentemente el objetivo de inmersión, aunque
para visualizar una preparación siempre se recomienda empezar por el objetivo
de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de
aumentos.
Al microscopio óptico hay dos formas de ver
las preparaciones:
1. Preparaciones en fresco con el
objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las preparaciones son muy
difíciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.
2. Preparaciones fijadas y teñidas
con el objetivo de inmersión. Se matan las bacterias, pero son más visibles y
su contraste es superior y de mayor calidad.
Entre los tipos de preparaciones del segundo
tipo, hay un método de tinción que se usa universalmente para distinguir a las
bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Coloración o Tinción de
Gram. Es una tinción diferencial que
basa su distinción en la estructura diferente de la pared bacteriana de las
bacteria Gram (+) (pared más gruesa, y una sola capa de peptidoglucano) y de
las Gram (-) (pared más delgada y dividida en dos partes).
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram
se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las
paredes celulares de los microorganismos. Los dos grupos
bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que
finalmente aparecen. Las bacterias Gram (+) se teñirán de azul por el cristal
violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las
bacterias Gram (-) perderán la coloración inicial del cristal violeta en los
siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina.
La
diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias
Gram (+) poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras
que las Gram (-), recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana
externa que envuelve toda la célula.
Una de las
precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase
exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. Por ejemplo, las
bacterias Gram (+) en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-).
2.
MATERIALES Y METODOS
Los
tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se
prepara la batería de colorantes para realizar la tinción de Gram presentan
algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede
ser necesario ajustar los tiempos.
En un laboratorio
de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer
pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram (+) y Gram (-)) para ajustar
así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones
que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.
Otra posibilidad es
adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más
caro.
Los pasos más estandarizados a nivel mundial,
son los siguientes:
a. Extensión:
En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se
coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente
esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de suspensión de
bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las
bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor, calentando
suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
La figura detalla a continuación el procedimiento
descrito.
b. Coloración:
a) 1 minuto en Cristal violeta de Hucker
(colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en solución de Lugol (mordiente)
d) se decolora con Alcohol de 95º
(decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en Fucsina o Safranina (colorante
de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel
de filtro
Una vez que la preparación está totalmente
seca, poner una gota muy pequeña de aceite de cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersión. A continuación, brindaremos algunos matices de
los colorantes empleados:
1. Colorante básico Cristal Violeta
o Violeta de Genciana: Es el primer colorante que se echa sobre el frotis
previamente preparado. Es un colorante selectivo que tiñe a todos los
microorganismos cargados
negativamente. Se
deja actuar durante un minuto y se lava con agua a continuación.
2. Solución de Lugol. Producto
compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente, que intensifica al
Cristal Violeta haciendo que precipite. Fija las tinciones
y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes
empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases Se deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para
que no se arrastre el colorante del todo.
3.
Alcohol 96º. El alcohol retira
el colorante de las Gram (-) debido a su diferente estructura de la pared
celular (tamaño de los poros). A veces se usa otro agente
decolorante o disolvente orgánico como alcohol-acetona (1:1).
4.
Safranina o Fucsina: Colorantes
básicos diferenciadores. Tiñen a las bacterias Gram (-). Se dejan actuar treinta segundos y se
lavan con agua. Siempre se añade
ésta contratinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de
color rojo y hacerlas más visibles. Se denominan bacterias Gram positivas a
aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que
quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción
de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los
estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la
flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos
de Koch de la tuberculosis
Como puede verse en definitiva y una vez
finalizada la tinción, las bacterias Gram (-) estarán teñidas de un color
rosáceo, y las Gram (+) de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas
claramente al microscopio óptico.
3.
OBSERVACIÓN
Debe utilizarse el objetivo de inmersión. Se
coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparación, se enfoca,
preferentemente, con el micrométrico. Después
de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol.
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Pared
Gram (+)
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* capa densa y uniforme de
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* ácidos teicoicos
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* polisacáridos
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* proteínas (pocas veces)
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* glicopéptido (50% del
peso seco)
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Pared
Gram (-)
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*capa interna delgada de
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* lipopolisacáridos
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* lipoproteínas
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* proteínas
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* glicopéptido (10% del
peso seco)
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Realmente, las matemáticas son muy usadas en diversos ámbitos de nuestras vidas http://bibliotheque-du-capucin.com/
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